孕妇血清白蛋白测定偏低

一、总蛋白测定

对生物体液（血清，尿夜和脑脊液）中总蛋白质含量的测定，首先要人为地做2个“假设”①所有蛋白质分子都由纯多肽构成，氮含量的质量百分比为16%；②体液中含有数百个蛋白质分子，每个分子对测定反应都具有非常相似的特性。当然，实际情况远远复杂得多。

用于生物体液中总蛋白的测定，人们已经建立起许多特异性的方法。重要的方法有，双缩脲法（根据所有蛋白质都含有肽键，在碱性溶液中能与铜离子发生双缩脲反应），紫外分光光度法（根据蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸在280nm波长的吸光度），染料结合法［根据蛋白质对考马（CBB）和氨基黑10B等染料的结合能力］，凯氏定氮法（根据蛋白质分子中含氮量恒定为16%），沉淀法（根据适当浓度的磺基水杨酸或三氯乙酸对蛋白质产生沉淀引起溶液的浑浊，进行比浊法测定）。

关于总蛋白测定的标准问题，正常人混合血清经凯氏定氮法准确定值后，是常规血清总蛋白测定最佳的标准液。牛或人血清白蛋白配制的标准液适用于双缩脲测定的校准，因为白蛋白有高纯度的商品制剂，分子中只含氨基酸不含糖基，分子含氮量恒定，每分子中肽键的数目也是已知的。对于染料结合法的校准，建议使用正常人血清或混合血清（具有正常的白／球比例），用凯氏定氮法定值。对于沉淀法的校准，牛或人血清白蛋白标准液不适用于磺基水杨酸沉淀法（因为磺基水杨酸对纯白蛋白产生的浊度比对血清中球蛋白产生的浊度要大2．5倍），但适用于三氯乙酸沉淀法的校准。

（一）双缩脲常规法

1．原理 所有蛋白质分子都含有肽键。在碱性溶液中，肽键和铜离子结合，生成蓝紫色的化合物，蓝紫色的化合物在450nm的吸光度与肽键的数量呈正比关系，可以计算蛋白质含量，这一反应称双缩脲反应。

2．试剂

（1）6．0mol／L NaOH溶液：使用新开瓶的优质氢氧化钠，减少碳酸盐的污染，称取240g NaOH溶于约800ml新鲜制备的蒸馏水或煮沸冷却的去离子水中，再加水至1L置于聚乙烯塑料瓶中，密封，室温中保存。

（2）双缩脲试剂：称取未风化，没有丢失结晶水的3．0g，溶解于500ml新鲜制备的蒸馏水或刚煮沸冷却的去离子水中，加酒石酸钾钠9．0g和碘化钾5．0g。待完全溶解后，加入6．0 mol／L NaOH溶液100ml，然后加蒸馏水至1L，置于聚乙烯塑料瓶中，密封，放室温中保存，至少可稳定6个月以上。该试剂在波长540nm的吸光度必须为0．095～0．105，否则要重新配制。

（3）双缩脲空白试剂：试剂中不含硫酸铜，其他成分和双缩脲试剂相同。

（4）蛋白标准液：可用正常人混合血清，经凯氏定氮法测定总蛋白浓度。最方便的是购买有批准文号的优质市售试剂盒。

3．操作 按表3－11进行操作

表3－11 血清总蛋白测定操作步骤

混匀，37℃10min，540nm，比色杯光径1．0cm用空白管调零，读取标准管和各测定管的吸光度。

当遇到血清脂浑浊、黄疸或溶血标本时，应设“标本空白管”，血清0．1ml加双缩脲空白试剂5．0ml，用双缩脲空白试剂调零波长540nm，比色杯光径1．0cm，读取标本空白管吸光度，用测定管吸光度减去标本空白管吸光度后的净吸光度。

4．计算

5．参考值 健康成年人走动后血清总蛋白浓度为64～83g／L；健康成年人静卧时，血清总蛋白浓度为60～78g／L。

6．附注

（1）血清蛋白质的浓度用“g／L”表示，因为血清中各种蛋白质的相对分子质量不同，所以不能用mol／L表示。

（2）双缩脲试剂法中各成分的作用：碱性酒石酸钾钠的作用是与铜离子形成络合物，并维持铜离子在碱性溶液中的稳定性；碘化物是抗氧化剂；双缩脲反应中铜离子肽键的羰基氧（carbonyl oxygen）原子与酰氨基氮（amide nitrogen）原子生成有色的络合物。

（3）吸光度的大小与试剂的组分、pH、反应温度有关。当试剂的组分、pH、反应温度等在标准化条件下测定时，可以不必每次做标准管，可根据比吸光度法计算蛋白质浓度。

（4）酚酞，溴磺酞钠在碱性溶液中呈色，影响双缩脲的测定结果。右旋糖酐可使测定管浑浊亦影响测定结果。理论上这些干扰都可用相应的标本空白管来消除，但如标本空白管吸光度太高，可影响测定准确度。

（5）氨基酸和二肽不发生双缩脲反应。三肽、寡肽和多肽与铜离子的双缩脲复合物，呈粉红色到红紫色。

7．临床意义

（1）血清总蛋白浓度增高

①血清中水分减少，使总蛋白浓度相对增高。凡体内水分的排出大于水分的摄入时，可引起血浆浓缩，尤其急性失水时（如呕吐，腹泻，高热等）变化更为显著，血清总蛋白浓度有时可达100～150g／L。又如休克时，由于毛细血管通透性的变化，血浆也可以发生浓缩。慢性肾上腺皮质功能减退患者，由于纳的丢失而致继发性水分丢失，血浆也可出现浓缩现象。

②血清蛋白质合成增加。大多发生在多发性骨髓瘤患者，此时主要是球蛋白的增加，其量可超过50g／L，总蛋白则可超过100g／L。

③结核性胸腔积液（或腹水）TP含量一般大于35g／L，胸腔积液（或腹水）TP和血清TP之比≥0．5。结核性脑膜炎患者CSF中TP含量常常升高，正常成人腰椎穿刺CSF中TP含量以磺基水杨酸一硫酸钠比浊法为150～450mg／L，结核性脑膜炎患者脑脊液中TP含量越高，预后越差。随有效化疗其含量逐渐降低。

（2）血清总蛋白浓度降低

①血浆中水分增加，血浆被稀释。如因各种原因引起的水钠潴留。

②营养不良和消耗增加。长期食物中蛋白含量不足或慢性肠道疾病所引起的吸收不良，使体内缺乏合成蛋白质的原料，或因长期患消耗性疾病，如严重结核病，甲状腺功能亢进和恶性肿瘤等，均可造成血清总蛋白浓度降低。

③合成障碍，主要是肝功能障碍。肝脏功能严重损害时，蛋白质的合成减少，以白蛋白的下降最为显著。

④蛋白质丢失。严重烫伤时，大量血浆渗出，或大出血时，大量血液的丢失；肾病综合征时，尿液中长期丢失蛋白质；溃疡性结肠炎可从粪便中长期丢失一定量的蛋白质，这些均可使血清总蛋白浓度降低。

（二）双缩脲比吸光度法

1．原理 按照Doumas方法所规定的配方配制双缩脲试剂，控制反应条件和校准分光光度计的情况下，双缩脲反应的呈色强度是稳定的，可以根据蛋白质双缩脲的复合物的吸光度，直接计算血清总蛋白质浓度。

2．试剂 同双缩脲常规法。

3．操作

（1）取试管2支，表明“测定管”及“试剂空白管”，各管准确加入双缩脲试剂5．0ml。

（2）于“测定管”中准确加入100μl血清，于“试剂空白管”中加入蒸馏水100μl。

（3）另取第3支试管作为“标本空白管”，加入双缩脲空白试剂5．0ml及血清100μl。

（4）各管立即充分混匀后，置（25＋1）℃水浴中保温30min。

（5）用经过校准的高级分光光度计，在波长540nm，比色杯光径1．0cm，读取各管吸光度。读“测定管”及“试剂空白管”吸光度时，用蒸馏水调零点。读“标本空白管”吸光度时，用双缩脲空白试剂调零点。

4．计算

式中，At为测定管吸光度；Ar为试剂空白管吸光度；As为标本空白管吸光度。

如测定所用的分光光度计波长准确，带宽≤2nm，比色杯光径准确1．0cm时，血清总蛋白含量可以根据比吸光度直接计算。

0．298为蛋白质双缩脲复合物的比吸光系数，是指按Doumas双缩脲试剂的标准配方，在上述规定的测定条件下，双缩脲反应溶液中蛋白质浓度为1．0g／L时的吸光度，双缩脲反应溶液中蛋白质浓度为1．0g／L时的吸光度。

检查比色杯的实际光径可按下述方法进行。

①每升含（NH4）Co（SO4）2·6H2O 43．00g的水溶液，在比色杯光径1．0cm，波长350nm时，吸光度应为0．556。

②每升含重铬酸钾0．050g的水溶液（溶液中含数滴浓硫酸）在比色杯光径1．0cm，波长350nm时，吸光度应为0．535。

③如测出的吸光度与上述不符，表示比色杯光径并非1．0cm，计算结果时需进行校正。校正系数F＝As／Am，As为钴盐的吸光度（0．535），Am为实测的吸光度。F可取两个校正系数的均值，用于下式计算蛋白的含量。

5．参考值 见双缩脲常规法。

6．临床意义 见双缩脲常规法。

二、白蛋白测定

测定血浆白蛋白和球蛋白，早期使用盐析法沉淀球蛋白，再用双缩脲法测定上清液中白蛋白和血清总蛋白，然后分别计算白蛋白和球蛋白浓度。该法操作烦琐，准确性差早已被淘汰。色氨酸法利用白蛋白具有2个独特的性质，白蛋白分子中色氨酸含量低（0．2%）和在pH 7．4环境中，白蛋白以阴离子形式存在。球蛋白分子中色氨酸含量高（2%～3%）。因而白蛋白含量忽略不计。先用色氨酸法（乙醛酸实验）测定球蛋白含量，再以双缩脲法测定总蛋白浓度，然后总蛋白浓度减去球蛋白浓度，即白蛋白浓度。该法因不能直接测定白蛋白，实际应用很少。

燃料结合法测定白蛋白，操作更容易，方法特异，现今大多数临床实验室，用BCG或BCP燃料结合发，进行白蛋白浓度自动分析测定。这些燃料多与白蛋白具有高度亲和力，通常监测燃料与白蛋白结合的初速率［initial rate of binding，指测定（30＋3）s的吸光度值］。该初速率与样品中白蛋白浓度呈正比。推荐用血清测定因为纤维蛋白原和肝素存在时，会引起白蛋白测定结果偏高。一些配体（ligand）如药物或代谢物，可与白蛋白结合。但一般情况下对燃料结合法测定没有显著影响，除非药物或代谢物浓度过高时。

（一）溴甲酚绿法

1．原理 在pH 4．2的缓冲液中，白蛋白分子带正电荷，与带负电的溴甲酚绿（BCG）生成蓝绿色复合物，在波长628nm处有吸收峰。复合物的吸光度与白蛋白浓度成正比，与同样处理的白蛋白标准比较，可求得血清中白蛋白的浓度。

2．试剂

（1）BCG试剂：向约950ml蒸馏水中加入0．105g BCG（或0．108g BCG钠盐），8．85g琥珀酸，0．100g叠氮钠和4ml Brij－35（聚氧化乙烯月桂醚，300g／L）。待完全溶解后，用6mol／L氢氧化钠溶液调节至pH 4．15～4．25。最后，用蒸馏水加至1L。储存于聚乙烯塑料瓶中，密封。该试剂置室温中至少可稳定6个月。

（2）BCG空白剂：除不加入BCG外，其余成分和配置程序完全同BCG试剂的配制方法。

（3）40g／L白蛋白标准液，也可用定制参考血清作白蛋白标准，均需配制并保存。

以上试剂建议应用有批准文号的优质商品试剂盒。

3．操作 按表3－12进行操作。

表3－12 溴甲酚绿法测定白蛋白操作步骤

分光光度计波长628nm，用空白管调零，然后逐管定量地加入BCG试剂，并立即混匀。每份血清标本或标准液与BCG试剂混合后（30＋3）s，读取吸光度。

如遇标本脂血浑浊，可做标本空白管：血清0．02ml，加入BCG空白试剂5．0ml，分光光度计波长628nm，用BCG空白试剂调节零点，读取标本空白管吸光度。用测定管吸光度减去标本空白管吸光度后的净吸光度，计算白蛋白浓度。

4．计算

目前，生化自动分析仪同时测定血清总蛋白（双缩脲法）和白蛋白（BCG法），并自动计算出球蛋白浓度和白／球蛋白比值。

5．参考值 4—14岁儿童，血清白蛋白浓度为38～54g／L。健康成人血清白蛋白浓度为34～48g／L。

6．附注

（1）BCG染料结合法测定血清白蛋白，用什么蛋白质作标准是一个复杂的问题。实验证明，BCG不但与白蛋白呈色，而且与血清中多种蛋白成分呈色，其中以α1球蛋白，转铁蛋白，触珠蛋白更为显著。但其反应速度较白蛋白较慢。实际上，当血清与BCG混合时，“慢反应”已经发生，不过实验证明，“慢反应”持续1h才能完成。因此有人主张用定值参考血清作标准比较理想。BCG与血清混合后，在30s读取吸光度，可明显减少非特异性结合反应。

（2）当60g／L的白蛋白标准与BCG结合后，比色杯光径1．0cm，在628nm测定吸光度应为0．811±0．035，如达不到此值灵敏度较差。

（3）此法测定正常血清标本的批间变异系数为6．3%左右。

（4）试剂中的聚氧化乙烯月桂醚也可用其他表面活性剂代替，如吐温20等，用量为2ml／L。

7．临床意义

（1）血清白蛋白浓度增高：血清白蛋白在肝脏合成。血清白蛋白浓度增高常由于严重失水，血浆浓缩所致，并非蛋白质绝对量的增加。临床上尚未发现单纯白蛋白浓度增加的疾病。

（2）血清白蛋白浓度降低：白蛋白浓度降低的原因与总蛋白浓度降低的原因相同。但有时总蛋白的浓度接近正常，而白蛋白的浓度降低，主要由于急性大量出血或严重烫伤时血浆大量丢失。慢性白蛋白浓度降低主要由于肝脏合成白蛋白功能障碍，腹水形成时白蛋白的丢失和肾病时白蛋白从尿液中的丢失。严重时，白蛋白浓度可低于10g／L。白蛋白浓度低于20g／L时，由于胶性渗透压的下降，常可见水肿等现象。

尤其妊娠晚期，由于体内对蛋白质的需要量增加，同时又伴有血浆容量增高，血清白蛋白可明显下降。但分娩后可迅速恢复正常。文献报道，还有先天性白蛋白缺乏症患者，由于白蛋白合成障碍，血清中几乎没有白蛋白，但患者不出现水肿。

（二）溴甲酚紫法

溴甲酚紫（bromocresol purple，BCP）可用于血清白蛋白测定，测定方法类似与溴甲酚绿法。BCP溶于pH 5．2的醋酸缓冲液中，呈黄色。用分光光度计，波长603nm，测定绿色复合物的吸光度，计算血清白蛋白浓度。手工法，需要在准确1min时读取吸光度。该法已有市售试剂盒供应，应用于自动分析仪，如DuPont仪器。支持溴甲酚紫法的学者声称，当使用人血清白蛋白校准品时，该法测定人血清或人源性质控血清中的白蛋白浓度，特异性优秀。但该方法不能用于动物源性的质控血清。

三、血清黏蛋白测定

黏蛋白是黏多糖与蛋白分子结合的复合蛋白质，是构成结缔组织的基质，具有多种复杂功能。它主要存在于α1及α2球蛋白部分，其黏多糖往往由氨基葡萄糖，氨基半乳糖，甘露糖，岩藻糖及唾液酸组成。黏蛋白成分比较复杂，分类和命名尚未一致。目前习惯上较实用的分类法是将糖与蛋白质以牢固的结合键连接的，含氨基己糖量小于4%的含糖蛋白质称为糖蛋白；大于4%者，糖与蛋白质以不牢固的极性键结合的含糖蛋白质称之为黏蛋白。

黏蛋白不容易发生热变性，也不容易被通常的蛋白沉淀剂（高氯酸，磺基水杨酸等）沉淀，而可被磷钨酸沉淀。临床检验中利用此特性将它与其他蛋白质分离后，再用蛋白试剂或糖试剂进行测定。目前测定黏蛋白的方法很多，其结果有以氨基己糖，己糖，络氨酸及蛋白质四种类型的表示方法，无论以何种方式表示结果，均需说明所采用的方法及参考值。

1．原理 以0．6mol／L过氯酸沉淀血清中蛋白质时，黏蛋白不被沉淀，仍存留在滤液中，再加磷钨酸使黏蛋白沉淀，然后以酚试剂测定沉淀物中蛋白质的含量。

2．试剂

（1）154mmol／L氯化钠溶液。

（2）1．8mmol／L过氯酸：取含量70%～72%过氯酸28ml，加蒸馏水稀释至200ml，并标定之。

（3）17．74mmol／L磷钨酸溶液：称取磷钨酸5g溶于2mol／L盐酸中，并加至100ml。

（4）酚试剂：于1 500ml球形烧瓶中加入钨酸钠100g中，钼酸钠25g，水700ml，浓磷酸50ml，浓盐酸100ml，缓缓回流蒸馏10h。取下冷凝管，加硫酸锂75g，蒸馏水50ml，并加溴水2～3滴，再煮沸15min，以除去多余的溴，冷却后稀释到1 000ml，制成的酚试剂鲜亮黄色，置棕色瓶保存，用前取出一部分，以等量蒸馏水稀释之。

（5）1．88mol／L碳酸钠溶液。

（6）标准：氨酸溶液（1ml＝0．05mg）精确称取酪氨酸5mg，以0．5mol／L盐酸溶液并稀释至100ml。

3．操作 血清0．5ml，加154mmol／L氯化钠4．5ml，混匀滴加1．8mol／L过氯酸溶液2．5ml，静置10min，用定量滤纸过滤或离心。取滤液2．5ml，加17．74mmol／L磷钨酸0．5ml混匀，静置10min，以每分钟3 000转离心10min，倾去上清液并沥干，再加磷钨酸溶液2ml，悬浮沉淀物，再次每分钟3 000转离心10min，倾去上清液并沥干，取沉淀物备用。按表3－13测定。

表3－13 血清黏蛋白测定操作步骤

注：溶解蛋白沉淀物

表中各管混匀，放入37℃水浴15min，取出各管冷却后，用分光光度计波长650nm，比色杯光径0．5cm，以空白管调零，读取各管吸光度。

4．计算

（1）血清黏蛋白（以白蛋白为计，g／L）＝测定管吸光度／标准管吸光度×0．012 5×7．5／2．5× 1 000／0．5×23．8／1 000＝测定管吸光度／标准管吸光度×1．785　　（式3－16）

式中23．8为酪氨酸转换为黏蛋白的系数。

（2）血清黏蛋白（以酪氨酸计，mg／L）＝测定管吸光度／标准管吸光度×0．012 5×7．5／2．5× 1 000／0．5＝测定管吸光度／标准管吸光度×75　　（式3－17）

5．参考值 健康成年人血清黏蛋白含量如下。

（1）以蛋白计，为0．75～1．35g／L。

（2）以酪氨酸计，为31．5～56．7mg／L。

6．附注

（1）黏蛋白中酪氨酸含量为4．2%，因此，两种方式可互相换算。

（2）加过氯酸沉淀蛋白后，需放置10min后再离心，倾取上清液，须细心操作，不能使沉淀消失，否则结果偏低。

7．临床意义

（1）血清黏蛋白增高常见于肿瘤（尤其是女性生殖器肿瘤）、结核、肺炎、系统性红斑狼疮、风湿热、风湿性关节炎、各种急性或慢性炎症、坏死、增生及外伤。

（2）血清黏蛋白含量降低，常见于肝细胞损伤及某些内分泌功能失调。如急性肝炎，门脉性肝硬化，雌激素分泌过多，甲状腺功能亢进，肾上腺、胰岛B细胞、垂体功能不足等。

（3）血清黏蛋白测定是一种非特异的辅助诊断指标，对于同一患者的病程转归（病变的扩大或缩小，肿瘤有无转移，肿瘤手术切除或其他治疗效果）的判断，连续测定有一定的参考价值。

四、脑脊液总蛋白测定

脑脊液蛋白质（CSF）蛋白质主要是静脉络膜丛上的毛细血管壁超滤作用而生成的，超滤过程已除去大部分血浆蛋白。还有一些蛋白质是CSF特有的蛋白，由中枢神经系统合成。CSF中总蛋白测定常用比浊法。由于白蛋白产生的浊度大于球蛋白产生的浊度，方法灵敏度低，重复性稍差，渐渐被少用。双缩脲法测定CSF蛋白，产生颜色很浅，只有用非常灵敏的仪器方可达到要求。酚试剂法（Lowry法）在欧洲常用，但费时，线性关系差，且氯氮，水杨酸类，四环素和碘胺类药物对测定有干扰。染料结合法的标准化尚存在问题，但样本用量少，也有采用。这里介绍3类方法供大家选用。

（一）邻苯三酚红钼络合显色法

1．原理 邻苯三酚和钼酸络合形成红色复合物（吸收峰在475nm）。该复合物在酸性条件下与蛋白质形成复合体，其吸收峰移至604nm。用比色方法，求出标本中蛋白质的含量。

2．试剂

（1）0．1mol／L甘氨酸－盐酸缓冲液（pH 3．0）：称取甘氨酸7．5g，氯化钠5．844g加蒸馏水至1 000ml。取此液81份加0．1mol／L HCl溶液19份，混匀即成。

（2）显色试剂：取邻苯三酚红27mg，钼酸铵30mg，用0．1mol／L甘氨酸－盐酸缓冲液（pH 3．0）溶解后，稀释至1 000ml置棕色瓶内，25℃以下保存。

（3）蛋白标准液：同脑脊液总蛋白浊度法测定。

3．操作 按表3－14脑脊液蛋白测定操作步骤。

表3－14 脑脊液蛋白测定操作步骤

表中各管混匀，室温下放置20min，在1h内用分光光度计波长604nm，比色杯光径1．0cm，空白管调零，读取各管吸光度。

4．计算

5．附注

（1）表面活性剂：如十六烷基三甲基溴化铵，Triton X－吐温对本试验均有干扰，实验中避免表面活性剂的污染。

（2）本法蛋白含量2g／L以下呈线性。

6．参考值 见染料结合法。

7．临床意义 见染料结合法。

（二）比浊法

1．原理 脑脊液中蛋白质与磺基水杨酸－硫酸钠试剂作用产生沉淀，所形成之浊度用比浊法测定，与同样处理的标准液比较，测得蛋白含量。

2．试剂

（1）磺基水杨酸－硫酸钠试剂：称取磺基水杨酸3．0g，无水硫酸钠7．0g，以蒸馏水溶解并稀释至100ml，必要时过滤后使用。

（2）叠氮钠生理盐水：称取氯化钠0．9g，叠氮钠0．1g，用蒸馏水溶解并稀释至100ml。

（3）蛋白标准液：将血清总蛋白测定用的标准液用叠氮钠生理盐水稀释成500mg／L后使用，冰箱保存。

3．操作 按表3－15进行。

表3－15 脑脊液蛋白测定操作步骤

表中各管混匀后放置10min，用分光光度计波长530nm，比色杯光径1．0cm，空白管调零，读取各管吸光度。

4．计算

5．附注

（1）磺基水杨酸－硫酸钠试剂放置日久，会产生微细沉淀，应弃去重新配制。

（2）如脑脊液蛋白浓度过高，超过线性范围一定要稀释后进行测定，否则影响结果。

（3）本法加试剂后10min内浊度进行增加，到10min时达到顶点，如遇絮状发生，应颠倒混合后进行比浊。

（4）常规使用时可绘制标准曲线。

6．参考值 见染料结合法。

7．临床意义 见染料结合法。

（三）染料结合法

1．原理 在柠檬酸存在的酸性条件下，伊红Y染料离解成阴离子型，染料的黄色消退，使试剂空白吸光度降低；另外，蛋白质多肽链中的精氨酸，组氨酸，赖氨酸和色氨酸残基，离解生成－NH－3基团，与染料阴离子的羧基和酚基借静电吸引而结合成红色蛋白染料复合物，其吸光度大小与蛋白质浓度成比例。

2．试剂

（1）0．1%伊红Y储存液。

（2）10%Brij－35溶液。

（3）显色剂：取0．1%伊红Y储存液3．75ml于50ml容量瓶内，加10%Brij－35溶液0．4ml，加蒸馏水至50ml刻度，摇匀，每次宜少量配制。

（4）10%枸橼檬酸溶液。

（5）蛋白标准应用液（700g／L）取70g／L总蛋白标准液1．0ml于100ml容量瓶中，用叠氮钠生理盐水稀释至100ml。

3．操作 按表3－16进行。

表3－16 脑脊液蛋白测定操作步骤

涡旋混匀，置室温10min，分光光度计540nm，比色杯光径1cm，以空白管调“0”，记录各管吸光度，30min内比色完毕。

4．计算

5．附注

（1）本法线性范围可达1 000mg／L，若CSF中蛋白含量过高，常规检查时潘迪实验达（2＋）者，测定时，CSF用量应适当减少，计算时相应修正。

（2）相同浓度的蛋白质，白蛋白呈色稍强，球蛋白稍低。

（3）本法呈色液在1～5min呈进行缓慢下降，10～30min趋于平稳，可稳定2h。

（4）该法是两步法，柠檬算是一个非常关键的试剂，其加入量必须准确，边加边摇匀，过多过少都会影响结果，用加样器定量加入，条件比较容易控制，实验的重复性也比较好。

6．参考值 健康成年人脑脊液蛋白150～450mg／L。

7．临床意义 测定CSF总蛋白主要用于检查血－脑屏障对血浆蛋白质的通透性增加或检查鞘内免疫球蛋白增加。

血－脑屏障对血浆蛋白质的通透性增加可由颅内压增高（由于脑肿瘤或脑内出血）引起，或由于炎症引起（细菌性或病毒性脑膜炎），脑炎或脊髓灰质炎所引起。CSF总蛋白显著升高见于细菌性脑膜炎；少量升高发生于其他炎症疾病及肿瘤或出血。当穿刺部位以上CSF循环机械梗阻时（由于脊髓肿瘤），此时血浆蛋白均衡越过脑膜毛细血管壁进入停滞的CSF，腰CSF蛋白则增加。关于CSF蛋白测定的临床意义，综合于表3－17。

表3－17 脑脊液蛋白测定的临床意义

五、β2微球蛋白测定（β2－M）

β2微球蛋白（β2－microglobulin，β2－MG）存在于所有有核细胞特别是淋巴细胞和肿瘤细胞表面，并由此释放入血循环或胸腔积液（或腹水）中。其分子量为11 800。

1．原理 微粒子酶免分析法（MEIA）。

反应过程：一般在反应的第一阶段，标本与微粒子以一定比例混合，标本中被检物质与微粒子上包被的抗体进行一定时间的反应。

第一反应终了后，反应液的一部分被移到玻璃纤维上，洗去未反应的被检物质与其他的不要成分。反应的第二阶段终了后，为了将未反应的第二抗体除去，再一次进行冲洗。

反应的第三阶段，加入基质液（MUP），基质液（MUP）被碱性磷酸酶所分解生成Methylumbelliferone。当该生成物受荧光照射后就产生荧光。

2．样本要求

（1）种类：人血清、血浆、尿液。

（2）要求：血清或血浆标本均应不溶血，血浆可用肝素或EDTA抗凝。

（3）保存：标本在2～8℃可保存24h；若不能及时测定在－20℃以下冷冻保存。

（4）样品用量：常规标本用量150μl；急诊标本用量105μl。

3．试剂及配套品

（1）试剂组成

试剂1：抗β2－M的鼠单克隆抗体（偶联碱性磷酸酶），最低浓度0．5μg／ml。

试剂2：包被有抗β2－M的鼠单克隆抗体的微粒。

试剂3：样本稀释液。

（2）试剂保存：保存于2～8℃，β2－M试剂不能被冷冻，β2－M试剂累计上机时间不能超过336h。

4．校准

（1）定标频率：每批试剂盒必须用新鲜试剂定标1次（如：试剂包在仪器上登记后不超过24h）。另外，以下情况需要再次定标。

①7d（放置仪器上的同一试剂盒）。

②根据要求进行定标：如质控结果超出范围时。质控至少2个浓度水平。

（2）质量监控：见内部质量控制程序和室间质量评价管理程序。

5．主要参数 见表3－18。

6．操作 试剂定标和质控操作以及样本检测常规操作，见仪器操作规程。

7．参考值 670～1 310μg／L。

8．检测范围 200～4 000μg／L，若β2－M浓度＞4 000μg／L，需用样品稀释液稀释20倍，计算结果时乘以稀释倍数。

9．干扰物质 溶血标本会影响β2－M测定结果。

表3－18 β2微球蛋白测定参数

10．可报告范围 200～80 000μg／L。

11．临床意义 β2－M是一种低分子量（11 800）的蛋白质，存在于几乎所有有核细胞的细胞膜上。β2－M是HLAI型抗原小的亚单位，与HLA重链以非共价键连接，并参与三级结构。由于淋巴系统是β2－M主要合成场所，因此使淋巴细胞增殖速率增加的各种情况均可使血清β2－M升高。尤其是多发性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病和其他恶性非霍奇金淋巴瘤。β2－M测定对这些疾病的监控和疗效是一个很好的指标。具有细胞免疫应答明显激活的其他疾病如某些自身免疫病、传染性单核细胞增多症、移植排斥反应等亦可引起血清β2－M水平升高。

结核性胸腔积液（或腹水）β2－M含量升高，一般多超过10 000μg／L，胸腔积液（或腹水）β2－M／血清β2－M之比≥2，而其他性质的胸腔积液（或腹水）（除恶性肿瘤外）β2－M含量几乎都低于5 000μg／L，恶性胸腔积液（或腹水）β2－M含量很少高于10 000μg／L，但常超过5 000μg／L。

六、铁蛋白（Ferritin）测定

铁蛋白（ferritin，Ft）是人体内重要的铁储存蛋白，由H和L两个亚基组成，分子量分别为21 000和18 500，PI为5．3～5．8。血清铁蛋白（serum ferritin，SF）水平是反映铁储备情况的最佳指标，因此，也用作缺铁性贫血的诊断指标，近年来人们还发现感染、肿瘤患者血清和胸腔积液（或腹水）中Ft含量升高，故也常以此作为恶性肿瘤的辅助诊断指标。

1．原理 采用双抗体夹心法原理，整个过程18min完成。

第1步，15μl标本、生物素化的抗铁蛋白单克隆抗体和钌（Ru）标记的抗铁蛋白单克隆抗体混匀，形成夹心复合物。

第2步，加入链霉亲和素包被的微粒，让上述形成的复合物通过生物素与链霉亲和素间的反应结合到微粒上。

第3步，反应混合液吸到测量池中，微粒通过磁铁吸附到电极上，未结合的物质被清洗液洗去，电极加电压后产生化学发光，通过光电倍增管进行测定。

检测结果由机器自动从标准曲线上查出。此曲线由仪器通过2点定标校正，由从试剂条形码扫描入仪器的原版标准曲线而得。

2．样本要求

（1）种类：人血清、血浆。

（2）使用容器：血清标本用13mm直径的含有分离胶的黄盖负压真空采血管，血浆标本用紫色盖或蓝色盖的负压真空采血管。

（3）要求：血清或血浆标本均应不溶血，血浆可用肝素、K3－EDTA或枸橼酸钠抗凝。接受高剂量生物素（＞5mg／d）治疗的患者，至少要等最后1次摄入生物素8h后才能采血。

（4）保存：标本在2～8℃可稳定7d，－20℃可稳定12个月，且只能冻融1次。

3．试剂及配套品

（1）罗氏诊断公司，Ferritin试剂，未开封2～8℃，可稳定至标明的保质期。开封后2～8℃，12周；在E170仪器试剂仓中，6周。

（2）试剂组成：Elecsys Ferritin试剂盒。

①M：链霉亲和素包被的微粒，1瓶，6．5ml。链霉亲和素包被的微粒浓度0．72mg／ml，生物素结合能力，470ng生物素／mg粒子。含防腐剂。

②R1：生物素化的抗铁蛋白单克隆抗体，1瓶，10ml。生物素化的抗铁蛋白单克隆抗体浓度3．0mg／L，磷酸缓冲液0．1mol／L，pH 7．4。含防腐剂。

③R2：Ru（bpy）32＋标记的抗铁蛋白单克隆抗体，1瓶，10ml。Ru（bpy）32＋标记的抗铁蛋白单克隆抗体浓度6．0mg／L，磷酸缓冲液0．1mol／L，pH 7．4。含防腐剂。

4．试剂使用

（1）此试剂为体外诊断使用，按照储存方法保存，避免冷冻。

（2）试剂盒中的试剂是一个整体，打开后可立即使用，不能被分开。

（3）装／卸载试剂操作和特殊情况处理，参见仪器操作规程。

5．校准

（1）校准品：德国罗氏诊断公司，Ferritin定标液。

（2）定标频率：每批试剂盒必须用新鲜试剂定标1次（如：试剂包在仪器上登记后不超过24h）。另外，以下情况需要再次定标。

①同一批号试剂1个月后（28d）。

②7d（放置仪器上的同一试剂盒）。

③根据要求进行定标：如质控结果超出范围时。

（3）质量监控 见内部质量控制程序和室间质量评价管理程序。

6．主要参数 见表3－19。

7．操作 试剂定标和质控操作以及样本检测常规操作，见仪器操作规程。

8．参考值 男性30～400ng／ml；女性13～150ng／ml。

9．线性范围 0．500～2 000ng／ml（由master定标曲线的最低检测限与最高检测限决定）。

10．稀释 高于检测范围的标本可用通用稀释液稀释。建议1∶50稀释。稀释后的标本Ferritin含量必须高于40ng／ml。如用手工稀释，结果应乘上稀释倍数。如果是机器自动稀释，机器会自动计算结果。

表3－19 铁蛋白测定参数

R1．试剂1；R2．试剂2；M．链霉亲和素包被的微粒

11．干扰物质

（1）该方法不受黄疸（胆红素＜65mg／dl）、溶血（血红蛋白＜0．5g／dl）、脂血（脂质＜3 300mg／dl）和生物素＜50ng／ml等干扰（标准，最初值的批内回收±10%）。

（2）不受类风湿因子干扰（2 500U／ml）。

（3）19种常用药物经试验对本测定无干扰。

（4）铁蛋白浓度高达高达100 000U／ml也不出现钩状效应。

（5）可报告范围：0．500～2 000ng／ml。

12．临床意义 铁蛋白的检测适用于了解体内铁代谢的状况。在治疗初期检测铁蛋白可反映当时体内铁的储量，可以早期发现网织内皮系统中铁储存的不足。在临床上，20ng／ml的阈值可以有效地判断准潜伏期铁不足并提示铁储存的耗竭。正常情况下储存铁可用于血红蛋白的合成。低于12ng／ml的铁蛋白阈值时，判断为潜伏期铁不足。以上2种判断值，不需要进一步的实验室参考资料，甚至在血象提供的形态学指标仍然正常的情况下，仍是如此。同时如伴有小细胞低色素性贫血，即可提示存在铁不足。如果铁蛋白水平较高，又排除了供铁不正常的可能性，即反映体内铁过量的状况。400ng／ml为判断阈值。铁蛋白升高还可见于下列肿瘤：急性白血病、霍奇金病、肺癌、结肠癌、肝癌和前列腺癌。检测铁蛋白对肝脏转移性肿瘤有诊断价值，76%的肝转移患者铁蛋白含量高于400ng／ml。升高的原因可能是由于细胞坏死、红细胞生成被阻断或肿瘤组织中合成增多。

活动性结核患者表现为缺铁性贫血，Ft多轻度下降，但受炎症的干扰，特别是痰中带菌者反而会升高。结核性胸腔积液（或腹水）中Ft含量多大于500μg／L，癌性胸腔积液（或腹水）中Ft含量多大于1 000μg／L，而其他性质的胸腔积液（或腹水）中Ft含量均小于500μg／L。

七、铜蓝蛋白（CER）测定

铜蓝蛋白（ceruloplasmin，CP）是一种含铜的α2糖蛋白，每分子含8个铜原子，由于含铜而成蓝色，故称之为CP。含糖约10%，末端唾液酸多与多肽链连接，由于它具有氧化酶活性，故又称铜氧化酶。CP也属于一种急性时相反应蛋白，在感染、创伤和肿瘤等时，血清中CP含量升高。故它可用作结核病是否活动及化疗考核的生化指标之一。

1．原理 散射比浊法，抗原抗体反应中形成免疫复合物，悬浮在缓冲液中使散射光信号发生变化，通过测定信号增长的速率决定抗原浓度。

2．样本要求

（1）样品种类：人血清。

（2）使用容器：血清标本用13mm直径的含有分离胶的黄盖负压真空采血管。

（3）要求：血样管应一直保持垂直地密闭保存。建议在收集时间后的2h内使用物理方法将血清和细胞成分分离。

（4）保存：如果血清样本在8h内不能进行检测，样本应保存在2～8℃。如不能在72h内进行检测，样本应在－15～－20℃冷冻保存。冷冻样本只能融化1次。如果重复冻融，样本中的分析物会发生变化。

3．试剂 CER试剂，4℃保存至有效期。BUFFER1、DILUTION1、WASH SOLUTION，常温保存。样本杯、稀释杯。

4．校准

（1）定标频率：每批试剂盒必须用新鲜试剂定标1次（如：试剂包在仪器上登记后不超过24h）。另外，以下情况需要再次定标。

①同一批号试剂1个月后（28d）。

②7d（放置仪器上的同一试剂盒）。

③根据要求进行定标：如质控结果超出范围时。

（2）质量监控：见内部质量控制程序和室间质量评价管理程序。

5．主要参数 见表3－20。

6．操作程序 试剂定标和质控操作以及样本检测常规操作，见仪器操作规程。

7．参考值 220～580mg／L。

8．干扰物质 该方法不受黄疸（胆红素＜30mg／dl）、溶血（血红蛋白＜0．5g／dl）和脂血（脂质＜600mg／dl）等干扰（标准，最初值的批内回收±10%）。

9．临床意义 活动性结核病和硅沉着病合并肺结核患者血清CP含量升高，且随病情的好转而降低。结核性脑膜炎患者CSF中CP含量升高，明显高于健康人和非结核性脑膜炎患者CSF中CP含量，且病情越重，CSF中CP含量越高，恢复期正常。用CP评价结核病病情严重程度较红细胞沉降率（ESR）更优。

表3－20 铜蓝蛋白测定参数

八、酸溶性蛋白测定

酸溶性蛋白（acid solution protein，ASP）是含糖较高的低分子蛋白质，可溶于高氯酸和磺柳酸，故称之为酸溶性蛋白，其主要成分是α1酸性蛋白和α1抗胰蛋白酶等，由肝脏和肿瘤组织或细胞等合成，在各种炎症时，可作为一种急性时相反应物。ASP测定方法常用考马斯亮蓝G250（coomassie brilliant blue G 250，CBG－250）显色。

1．原理 将待检标本加入高氯酸，沉淀除去其他蛋白质，上清液中含ASP，加入CBG－250，其吸收峰由465nm移至595nm，595nm时吸光度与蛋白质含量呈线性关系。

2．试剂

（1）CBG－250试剂：CBG－250 100mg溶于95%乙醇中，加重蒸馏水约800ml，加85%磷酸100ml，补足蒸馏水至1 000ml，滤纸过滤后加浓HCl 10ml。

（2）0．6mol／L高氯酸。

（3）ASP标准液：收集健康人血清50ml，加入0．5mol／L磺柳酸溶液500ml，混匀置室温20min，以每分钟3 000转离心20min，收集上清液，置透析袋内以无离子水中透析24h，以PEG 6 000将其浓缩10倍，再以100mg／L白蛋白标准液，经CBG－250显色再用0．5mol／L磺柳酸将上述标准液稀释至250mg／L的标准应用液，置冰箱中保存，可稳定3个月。也可直接以白蛋白作标准。

3．方法 取血清或胸腔积液（或腹水）0．2ml，加入0．6mol／L高氯酸0．8ml，混匀后，以每分钟2000转离心15min，取上清液0．2ml和标准液0．2ml，各加CBG－250 5ml混匀，2min后于595nm测其A值。

4．计算

5．参考值 血清0．8～1．5g／L。

6．临床意义

（1）活动性肺结核患者血清ASP含量升高，随有效化疗的进行而下降。可用作为肺结核疗效评价的指标之一。

（2）结核性胸腔积液（或腹水）中ASP含量常高于1．0g／L。