测定血清氯化物的方法

氯的测定_生物化学检验技术

测定血清氯的方法有:核素稀释质谱法(一般使用37 Cl,为测定氯的决定性方法)、ISE法、酶法、硝酸汞滴定法、硫氰酸汞比色法和库仑电量分析法(被推荐为测定氯的参考方法)。

(一)离子选择电极法

是目前测定Cl-最好的方法,氯电极是由AgCl、FeCl3-HgS为膜性材料制成的固体膜电极,对样本中的Cl-有特殊响应。ISE法简便、快速、准确,已成为临床实验室测定K+、Na+、Cl-最常用的方法。

(二)库仑电量分析法

在库仑电量分析仪上测定,从银电极上释放的Ag+与待测标本中的Cl-反应形成不溶解的AgCl沉淀。当Cl-全部与Ag+结合后,溶液中游离的Ag+使电导性明显增加,传感器和计时器切断电流,计算消耗Cl-所需的时间,与Cl-浓度有关,再与标准液所需时间比较,换算出标本中Cl-的浓度,结果用mmol/L表示。

此法简便、快速、准确度较高,应用最广。Br-和I-有一定干扰,因量少可忽略不计。

(三)酶法

利用α-淀粉酶催化2-氯-4-硝基苯-α-D-麦芽三糖苷,解离成麦芽三糖(G3)和2-氯-4-硝基酚(CNP),后者在405nm有最大吸收峰,连续监测吸光度变化可反映CNP的生成量,后者与酶的活性成正比。Cl-是α-淀粉酶的激动剂,反应速率可反映标本中Cl-的浓度。

因本法底物分子量小,用量少,不需葡糖苷酶偶联,经济实用,同时具有离子特异性好,反应温和、无污染,特异性、精密度和线性范围均较好,测定结果与库仑电量法和ISE法有很好的相关性,是有发展前途的方法,国内尚未推广。对于Ca2+的影响可用EDTA消除。

(四)硫氰酸汞比色法

【原理】 Cl-与硫氰酸汞作用,生成不易解离的氯化汞和与Cl-等当量的硫氰酸根(SCN-),后者与Fe3+反应生成橙红色的硫氰酸铁,在460nm处比色,测定标本中Cl-的含量。

【器材与试剂】

1.饱和硫氰酸汞溶液 称取硫氰酸汞2.0g,溶于去离子水1000ml,室温放置48h,并经常摇动,用时取上清液。

2.硝酸汞溶液 称取Hg(NO 3)2 6.0g,溶于去离子水50ml,加浓硝酸1ml定容至100ml。

3.显色应用液 称取硝酸铁[Fe(NO3)2·9 H 2 O]13g,加去离子水400ml溶解,再加浓硝酸1.5ml、饱和硫氰酸汞液500ml和硝酸汞溶液5ml,最后用去离子水定容至1000ml,用塑料瓶存放,置室温保存。

4.1mol/L NaCl校准储存液 准确称取经干燥、恒重的NaCl 22.225g,加去离子水溶解定容至500ml,4℃保存,可长期使用。

5.0.1mol/L NaCl校准应用液 取NaCl校准储存液10ml于100ml容量瓶中,加去离子水稀释至刻度,摇匀备用。

6.空白试剂 称硝酸铁13g,溶于去离子水40ml,加浓硝酸1.5ml,用去离子水定容至1000ml。

【操作】 取4支试管,标明试剂空白管、校准管、测定空白管和测定管,按表8-4操作。

表8-4　硫氰酸汞比色法测定血清氯化物的操作步骤

【参考区间】 血清氯化物:96~108mmol/L。

【质量保证】

1.测定血清氯化物时,采血后应迅速分离血清,以免血清CO2逸散至红细胞内使Cl-外移。室温放置4h,血清氯化物可增高1.5%~2%。肉眼可见的溶血对测定结果干扰较小,因为红细胞中Cl-浓度远低于血清或血浆。

2.本测定方法对其他卤族元素如F-、Br-、I-也同样呈色,但正常人血清中此类元素含量极少,不影响测定结果。如用含上述离子药物治疗者,血清氯测定结果偏高。

3.显色液的显色强度与硫氰酸汞和硝酸汞的含量有关。如呈色过强,线性范围<

混匀,室温放置10min,试剂空白管调零,在460nm处比色,读取各管吸光度。

【计算】125mmol/L时,需增加硝酸汞的用量;如呈色太弱,需增加硫氰酸汞的用量。使用前两者要进行调整,使其吸光度在0.4左右为宜(比色杯光径1.0cm)。

4.硫氰酸铁反应对浊度要求非常敏感,其呈色温度应在20℃以上。室温过低易产生浑浊,影响比色。吸光度随温度升高而增加,必须同时做校准管,不宜使用剂量反应曲线。

5.每批应同时测定正常和异常值的质控血清,结果应在允许误差范围内。

【应用评价】

1.线性范围 应在75~125mmol/L,超线性范围,应将血清用蒸馏水进行1∶1稀释重测,其结果乘以2。

2.精密度 批内CV平均为0.777%,批间CV平均为1.34%。

3.回收率 低、中、高校准回收率分别为101%、97%、102.5%,平均为100.1%。

4.显色稳定性 用高、低氯含量标本及校准品呈色后2h内颜色稳定。

5.本法适用于自动生化分析仪 按试剂盒要求操作。

(五)硝酸汞滴定法

【原理】 用标准硝酸汞溶液滴定血清Cl-,生成溶解而不解离的氯化汞。当滴定到达终点时,过量的汞离子与汞指示剂——二苯卡巴腙作用,生成淡紫红色的络合物,根据硝酸汞的用量,推算出氯化物的浓度。

【器材与试剂】

1.2.5mmol/L硝酸汞溶液 称取硝酸汞[Hg(NO3)2·6H 2 O]0.875g,溶于含有3ml浓硝酸的去离子水1000ml,配制后放置2d,经滴定标化后使用。

2.指示剂 称取二苯卡巴腙0.1g,溶于100ml的95%乙醇中,置棕色瓶内,于冰箱内可保存1个月。

3.100mmol/L氯化物标准液 配制方法同硫氰酸汞比色法。

4.钨酸蛋白沉淀剂 取1mol/L硫酸50ml,100g/L钨酸钠150ml,85%浓磷酸0.15ml,加蒸馏水2500ml混匀,贮存塑料瓶内。

【操作】

1.直接滴定法 向试管内加入血清0.1ml,加去离子水1ml,指示剂2滴,混匀,此时立即出现“肉红色”。用硝酸汞溶液以微量滴定管进行滴定,边滴边混匀,直至液体出现淡紫红色为终点,记录硝酸汞溶液的用量(ml)。向另一试管内加入氯化物标准液0.1ml,同标本一样滴定,记录硝酸汞溶液的用量(ml)。

2.血滤液滴定法 如标本溶血、黄疸、重度浑浊,直接滴定法难以观察终点。可取血清0.2ml于小试管中,加入钨酸蛋白沉淀剂1.8ml,边加边摇,放置数分钟后离心。取血滤液1ml于试管中,加指示剂2滴,同上法一样滴定,记录硝酸汞溶液的用量(ml)。

【计算】

【参考区间】 血清(浆)氯化物96~108mmol/L;脑脊液氯化物120~132mmol/L;尿氯化物170~250mmol/L。

【质量保证】

1.试验所用器皿必须干净,滴定管固定专用,以保证结果准确一致。

2.取血后应迅速分离血清或血浆,避免血浆中二氧化碳与红细胞内氯离子发生转移,使测定结果偏高。

3.直接滴定法结果比去蛋白者高1~2mmol/L,可能部分汞离子与蛋白质结合的缘故。

4.脑脊液、尿液标本如浑浊或含有血液,应离心后取上清液进行测定。

5.氯化物滴定法的指示剂有2种:一种为二苯卡巴腙(又称二苯胺脲,化学名称为苯基碳偶氮苯或二苯偶氮碳酰肼),该指示剂终点明显,稳定。另一种为二苯卡巴肼(化学名称是二苯基碳酰二肼),终点不太明显,变色迟缓,一旦变色后又很快变成深色。就灵敏度而言,前者比后者约高3倍。配好的指示剂应避光保存。

6.此法的标本应为弱酸性(约p H6.0),滴定终点明显;若标本偏碱,加指示剂后出现淡粉红色,应加稀硝酸数滴,使粉红色消失后再滴定,但过酸(p H<4.0)终点也不明显。

【应用评价】

1.采用汞与二苯卡巴腙络合物形成的滴定终点,方法简便,易于推广。缺点是终点不易判断,且易受蛋白、胆红素、血红蛋白、血脂等干扰,卤素的盐类也有干扰。此法精密度差,是最早测定Cl-的方法之一,现一般不使用。

2.滴定法受多种因素影响,易产生误差。因此,要求操作熟练、准确,尽可能排除主观因素的干扰,血液标本须用钨酸去除蛋白质后再行滴定。血清中过多的胆红素、血脂及血红蛋白对结果影响很大。

3.每日在滴定标本的同时,须与定值质控血清一起进行,以保证结果的准确性。

【临床意义】

1.血清氯化物增高 常见于高钠血症、失水大于失盐、氯化物相对浓度增高、高氯血症代谢酸中毒等。

2.血清氯化物减低 临床上较多见,如严重呕吐、腹泻、胃液及胰液或胆汁大量丢失、长期限制氯化钠的摄入或摄入减少、艾迪生病、抗利尿激素分泌增多。

3.脑脊液低氯症 重症结核性脑膜炎氯化物含量显著降低,化脓性脑膜炎偶尔减少。重症中枢神经系统感染、抗利尿素分泌增多、水潴留等脑脊液氯化物也降低。