氨基转换作用的测定(分光光度法)

实验九　氨基转换作用的测定(分光光度法)

【实验目的】

1．了解转氨酶在生物体中的生理功能。

2．掌握测定转氨酶催化氨基转换作用的原理和方法。

【实验原理】

体内氨基酸的氨基转移反应是由转氨酶催化完成的。转氨酶催化α-氨基酸的α-氨基与α-酮酸的α-酮基之间的相互转化，从而生成一种新的氨基酸与一种新的酮酸，这种作用称为转氨基作用。它在生物体内蛋白质的合成、分解等中间代谢过程中，在糖、脂及蛋白质三大物质代谢的相互联系、相互制约及相互转变上都起着很重要的作用。

在动物机体中活力最强、分布最广的转氨酶有两种:一种为谷氨酸丙酮酸转氨酶(简称GPT)，另一种为谷氨酸草酰乙酸转氨酶(简称GOT)。它们的催化反应如下:

GOT催化生成的草酰乙酸在柠檬酸苯胺的作用下转变为丙酮酸与二氧化碳。由上可见此反应最终产物都是丙酮酸。测定单位时间内丙酮酸的产量即可得知转氨酶的活性。丙酮酸可与2，4-二硝基苯肼反应，形成丙酮酸二硝基苯腙，在碱性溶液中显棕红色。再与同样处理的丙酮酸标准液进行比色，计算出其含量，以此测定转氨酶的活性。转氨酶的活性单位为:每毫升血清与基质在37℃下作用60min，生成1μmol丙酮酸为1个单位。

丙酮酸+2，4-二硝基苯肼→丙酮酸二硝基苯腙(棕红色)

【药品试剂】

1．磷酸盐缓冲液(pH7．4):取甲液825 ml，乙液175 ml，混合，pH值为7．4即可使用。

甲液:1/15 mol/L磷酸氢二钠溶液:称取磷酸氢二钠(Na₂HPO₄) 9．47 g(或Na₂HPO₄·12H₂O23．87 g)溶于蒸馏水，定容到1000 ml。

乙液:1/15 mol/L磷酸二氢钾溶液:称取磷酸二氢钾(KH₂PO₄) 9．078 g，溶于蒸馏水，定容至1000 ml。

2．GPT基质液:称取α-酮戊二酸29．2 mg及DL-丙氨酸1．78 g，溶于pH7．4的磷酸盐缓冲液20 ml中，溶解后再加缓冲液70 ml，并移入100 ml容量瓶内。加1 mol/L的NaOH溶液0．5 ml，校正pH值至7．4。再用pH7．4磷酸缓冲液定容到100 ml。4℃可保存一周。

3．GOT基质液:称取α-酮戊二酸29．2 mg及DL–天冬氨酸2．66 g，溶于pH7．4的磷酸盐缓冲液20 ml中，溶解后再加缓冲液70 ml，并移入100 ml容量瓶内。加1 mol/L的NaOH溶液0．5 ml，校正pH值至7．4。再以pH7．4的磷酸缓冲液定容到100 ml。4℃可保存一周。

4．2，4-二硝基苯肼溶液:称取2，4-二硝基苯肼20 mg，先溶于10 ml浓盐酸中(可加热助溶)，再以蒸馏水稀释至100 ml(有沉渣可过滤)，棕色瓶内保存。

5．丙酮酸标准液(2μmol/mL):精确称取丙酮酸钠22 mg，溶解后转入100 ml容量瓶中，用磷酸缓冲液(1/15 mol/L，pH7．4)稀释至刻度。

6．0．4 mol/L氢氧化钠溶液。

7．血清。

8．柠檬酸苯胺溶液:取柠檬酸50 g溶于50 ml蒸馏水中，再加苯胺50 ml充分混合即成，低温出现结晶时，可置于37℃水浴中，待溶解后使用。

【实验方法】

1．标准曲线制作:取6支试管按表5-12操作。

表5-12　　　　　　　丙酮酸标准浓度曲线的制备

混匀后，在520 nm波长处，以空白调“0”点，读取各管光密度。以单位值为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线。

2．GPT(GOT)测定:取2支洁净的试管按表5-13操作。

表5-13　　　　　　　血清GTP活性测定

GPT测定不加柠檬酸苯胺溶液，其他操作方法同GOT测定法。

3．实验结果及计算:由所测得测定管之光密度值直接查丙酮酸标准曲线，即可得丙酮酸的μmol数(用1μmol丙酮酸代表1．0单位酶活力)，计算100ml血清中转氨酶的活性单位。

【思考题】

1．转氨酶在物质代谢过程中有什么重要作用?

2．血清转氨酶活性测定有什么意义?