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蛋白质电泳结果怎么分析

时间:2021-10-19 百科知识 版权反馈
【摘要】:原生质是生命现象的物质基础,蛋白质和核酸则是构成细胞内原生质的主要成分。蛋白质定量测定的基本方法包括紫外吸收、化学呈色和电泳染色。前处理是指把目的蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来,并保持原来的天然状态,不丧失生物活性。细分级分离是指样品的进一步纯化,能用于分离纯化绝大多数蛋白质混合物。为了更好地满足实验需要,我们往往需要保证在蛋白质保持生物学活性的基础上进行浓缩。
蛋白质_生物化学实验指导

第三章 蛋白质

原生质是生命现象的物质基础,蛋白质和核酸则是构成细胞内原生质的主要成分。在蛋白质的研究中,通常会遇到以下几个问题:①蛋白质的定量测定;②蛋白质的纯度和亚单位的检测;③蛋白质的分离和纯化;④蛋白质的浓缩。

蛋白质定量测定的基本方法包括紫外吸收、化学呈色和电泳染色。紫外吸收法的原理是基于蛋白质分子中具有共轭双键的芳香族氨基酸残基——酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸对280 nm的紫外光有最大吸收,在一定浓度范围内,蛋白质含量与该波长下的光吸收值成正比,因此可以通过测蛋白质在280 nm下的光吸收值来计算蛋白质的浓度。化学呈色定量法是最为简便可行并且经典的蛋白质定量的方法,其基本原理是显色剂与蛋白质结合后,颜色发生变化,即最大光吸收峰的波长发生变化;且在一定浓度范围内,在最大吸收峰相应的波长光激发下,光密度和蛋白质含量呈线性关系,因此可以用于蛋白质含量的测定。最常见并可信的化学呈色定量法包括经典的Bradford法、Lowry法以及近年来常用的BCA定量法。电泳染色定量的原理在于将未知浓度的蛋白质与已知浓度的标准蛋白质同时进行电泳(单向或双向),通过对蛋白胶染色或是对承载有蛋白质的膜进行染色,对待测蛋白质和标准蛋白质的染色浓度进行比较而计算出待测蛋白质的浓度。利用蛋白质特异性的单克隆或是多克隆抗体对蛋白膜进行免疫染色(即Western Blot)也能用来进行蛋白质定量。以上诸多方法各有其优缺点和最适合的应用领域,实验者应根据实验目的和实验需求,选择最合适的方法。我们将在本章节中重点介绍紫外吸收法、Lowry法、Bradford法、BCA定量法、单向蛋白电泳(即聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳)、电转印、免疫印迹法及若干凝胶及膜的染色方法。

蛋白质的纯度和亚单位的检测可以通过电泳和色谱分析等方法联合起来进行分析。在蛋白质中加入变性剂能破坏蛋白质的二硫键和次级键,如氢键、离子键和疏水键,引起天然构象的解体;但并不破坏肽键,因此一级结构得以保存。常见的溶解型变性剂有SDS、胍盐和尿素,而常用的破坏蛋白质内二硫键的变性剂为DTT和巯基乙醇。通过变性条件和非变性条件下的电泳能分析蛋白质的二级结构和纯度。例如:待测蛋白只有一个亚单位或者有多个相同亚单位的单一蛋白,在变性条件下进行单向蛋白电泳或是双向电泳,染色后的结果将是单一的蛋白条带或蛋白点。如果待测蛋白质含有多个不同分子量的亚单位,在非变性条件下进行蛋白电泳,将可以看到单一的条带(高纯度),而在变性条件下的蛋白电泳胶上将出现多个条带。一旦待测蛋白质被证明是纯蛋白质,非变性条件下的凝胶层析法就可以用来鉴定该待测蛋白质的分子量;而变性条件下的凝胶层析法可以用来测定待测蛋白质各亚单位的分子量。在本章节中,我们将重点介绍非变性条件下的凝胶电泳和等电聚焦电泳实验。

蛋白质的分离和纯化已经有200多年的历史,不论是工业化大规模制备单一蛋白(如临床用血清白蛋白、基因工程用的核酸酶等),还是实验室小规模科研需要对某一特定蛋白质的功能进行研究,把特定蛋白质从复杂的混合物中完全分离纯化出来都需要充分利用该蛋白质的固有特性——大小形状、电荷、表面特征和生物学活性。

在通常情况下,蛋白质的分离纯化需要前处理、粗分级分离和细分级分离三个步骤。前处理是指把目的蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来,并保持原来的天然状态,不丧失生物活性。包括组织和细胞破碎、细胞器差速离心等步骤。粗分级分离是指用简便易行的方法去除大量核糖、盐类等杂质和理化性质差别较大的杂蛋白的方法,包括盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法。细分级分离是指样品的进一步纯化,能用于分离纯化绝大多数蛋白质混合物。例如:利用蛋白质的大小和形状,可以采用分子筛等方法;利用蛋白质表面的特征(如电荷分布、亲水疏水特性等),可以采用盐析、疏水色谱等方法;利用蛋白质的等电点的不同,可以采用离子交换层析法;而利用蛋白质的固有特性,如与某种物质有特殊高亲和力等,可以采用亲和层析及免疫亲和层析等方法。经电泳和色谱分离后的蛋白质能通过气相蛋白测序仪或是质谱分析确定蛋白质的氨基酸组成序列。由于分离和纯化蛋白质的目的除了测序之外,通常是为了进行功能学方面的分析研究,而处于变性条件下的蛋白质通常会因为蛋白质三维结构的改变,而失去其生物学活性,因此在分离和纯化蛋白质的各级步骤中,务必注意保持蛋白质处于非变性条件,而蛋白电泳也往往被安排在分离纯化蛋白质的最后一步。层析实验原理和分类以及具体的分子筛、离子交换层析和亲和层析这些常用的实验操作方法将是我们介绍的重点。

通过分离和纯化,我们通常能获得纯度较好的蛋白质。为了更好地满足实验需要,我们往往需要保证在蛋白质保持生物学活性的基础上进行浓缩。常用的蛋白质浓缩方法包括硫酸铵沉淀法、聚乙二醇沉淀法、三氯乙酸(TCA)沉淀法、超滤法等。我们将在本章节中对硫酸铵沉淀法和TCA沉淀法进行详述。

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