化学发光法的原理

13．2．5　化学发光法

13．2．5．1　原理

黄嘌呤氧化酶在有氧条件下，催化底物黄嘌呤或次黄嘌呤发生氧化反应生成尿酸，同时产生。可与化学发光剂鲁米诺反应，使其产生激发。当后者从激发态返回基态时就向外发光，这种现象称为化学发光。SOD能清除，遂可以抑制鲁米诺的发光。利用这一原理，采用黄嘌呤或次黄嘌呤－黄嘌呤－鲁米诺作为发生与发光体系，应用于SOD微量测定，不仅灵敏度高，简便易行，而且专一性与准确性至少与细胞色素c还原法类似。

13．2．5．2　仪器及试剂

（1）仪器：发光检测仪。

（2）试剂：①0．05mol/L、pH为7．8的磷酸钾缓冲液，含0．1mmol/L EDTA。②0．1mol/L、pH为7．8的磷酸钾缓冲液，含0．1mmol/L EDTA。③黄嘌呤氧化酶（XO）：从牛奶中提取，储存在60%饱和度的硫酸铵中，浓度为1mg/mL。用前摇匀，吸取悬液，以5　000×g离心10min，弃上清液，浅棕色沉淀物用0．05mol/L、pH为7．8的磷酸钾缓冲液溶解，浓度为1mg/mL。④发光液：用前以上述0．1mol/L、pH为7．8的磷酸钾缓冲液临时配制，含各为0．1mmol/L的次黄嘌呤（HX）及鲁米诺（luminol，简称L）。

13．2．5．3　步骤

（1）采用高为55cm、内径为10mm的无色透明硬质玻璃管为测定管。注入待测样品液10μL，对照管以等体积0．05mol/L、pH为7．8的磷酸钾缓冲液代替。

（2）注入1mg/mL黄嘌呤氧化酶（XO）50μL。

（3）加入发光液940μL启动反应，开动记录仪，记录发光峰值。

13．2．5．4　SOD酶活性计算

（1）活性单位定义：在规定测定条件下，25℃，抑制50%发光所需的SOD量为一个活性单位。单位体积（每mL）或单位蛋白质量（每mg）样品中所含的SOD酶活性单位数，称样品的SOD酶比活。

（2）以对照管的发光峰值读数（A₀）为100%，根据样品管测得的发光峰值读数（A_s），计算样品管中SOD对发光峰值的抑制程度（%）＝（A₀－A_s）/A0，并由SOD酶活性单位定义计算出样品中的SOD酶活性，可进一步求样品的酶比活。

13．2．5．5　注意事项

（1）本法测定所用缓冲液可用0．05mol/L的碳酸钠缓冲液（pH为7．2，含0．1mmol/L EDTA）代替。但测定时测定管内应依次加入发光液980μL、黄嘌呤氧化酶溶液（0．1mg/mL）10μL、待测样品液10μL。其余步骤相同。

（2）如有SOD标准品，则可配制不同浓度的SOD标准液，测定其对反应体系发光的抑制百分率，并绘制标准曲线，由此可计算得出样品中的SOD含量。

（3）固定次黄嘌呤及鲁米诺的浓度，在一定浓度范围内随黄嘌呤氧化酶的用量增加发光强度增加，并逐渐达饱和状态。在黄嘌呤氧化酶过量的条件下，发光强度则由次黄嘌呤及鲁米诺的浓度决定。因此，为保证测定的稳定性与重复性，一般要求试剂用量固定，使黄嘌呤氧化酶、次黄嘌呤与鲁米诺的浓度维持在最适浓度。

（4）本法的灵敏度受测定体系pH值的影响，随pH升高，测定灵敏度增高。如用pH为10．2的发光体系，可检测出10^－10～10^－11mol/L的SOD。当黄嘌呤氧化酶过量时，会使本法测定灵敏度降低。

（5）本法特点有：响应时间短，可以在测量部位上注入反应液启动反应，立即检测，这样可以跟踪反应初速度，少受产物及其他因素的干扰；灵敏度高，应用特定的发光测量装置可以测定微弱的化学发光，大大提高测量灵敏度；专一性强，鲁米诺的化学发光受自由基的激发，且在测定中不受乙醇、氯仿及丙酮等有机溶剂的影响，适用于粗提样品的测定；分析快速，由于化学发光法响应时间短、灵敏度高，适用于样品的快速测定；样品用量少，对于常规的重复性测量及相对活性比较很有好处。

（6）本法中用作检测的发光剂鲁米诺，可用其他发光剂代替，近来Laihia等用光泽精（lucigenin）作为发光剂取得了良好的效果。具体方法如下：反应体系为黄嘌呤氧化酶（420mu/mL）20μL、0．1mmol/L lucigenin 20μL、200mmol/L亚油酸（溶于50mmol/L KOH）20μL、50mmol/L磷酸钾缓冲液（pH为10．0）385μL与待测样品液或SOD标准液（以等量缓冲液作对照）的混合液55μL。向测定体系中加入60μL 1．45mmol/L黄嘌呤以启动反应，最终总体积为550μL。所用试剂须用50mmol/L磷酸钾缓冲液（pH为10．0）新鲜配制，其中除黄嘌呤溶液置于室温外，其他试剂溶液均应于冰水浴中放置。发光检测仪预温至35℃，启动化学发光反应后每隔1min测一次发光强度值，直至10min，记录发光峰值。根据样品对测定体系化学发光的抑制率，由标准曲线计算样品SOD酶活性。本法有以下一些特点。

①用标准品测试，当化学发光抑制率在8．5%～98．3%时呈良好线性关系，最大抑制率可达99．9%。

②对照管的本底发光值极低，低于测定值的0．06%。

③本法中加入亚油酸的目的是增强lucigenin的发光强度，提高测定灵敏度，其原理类似于去污剂对lucigenin化学发光的增强作用。

④本法对Cu，Zn－SOD的最低检出限可达0．01ng/mL，相当于测定杯中含有0．17fmol Cu，Zn－SOD，远高于免疫学法等方法。

⑤lucigenin对的敏感性及特异性较鲁米诺要好，因此，在应用于化学发光法检测SOD活性方面优于鲁米诺。

⑥样品中的水杨酸、还原型谷胱甘肽等成分因为可以清除等活性氧自由基，同样可以抑制该测定反应的化学发光，从而影响测定结果，故对不同样品的SOD活性进行比较时，应注意保持样品制备过程中以上成分含量的均衡。对于血浆及细胞、组织匀浆样品，测定前可进行稀释，使以上成分对测定结果影响减至最小。

⑦高倍稀释的样品中的SOD活性会迅速降低，因此，应尽量采用新鲜样品，并在最短时间内测定。

⑧本法测定结果代表样品中SOD的总活性，且是特异性的抗氧化活性。