法和丙酮法沉淀浓缩蛋白质

实验十四　TCA法和丙酮法沉淀浓缩蛋白质

【实验目的】

1．了解TCA法和丙酮法沉淀浓缩蛋白质的原理。

2．了解TCA法和丙酮法沉淀蛋白质的优缺点。

【实验原理】

蛋白质能被某些有机溶剂沉淀下来，一方面是由于甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂加入水中使溶剂介电常数降低，增加了相反电荷的吸引力，另一方面是因为这些有机溶剂是强亲水试剂，争夺蛋白质分子表面的水化水，破坏蛋白质胶体分子表面的水化层而使分子聚集沉淀。在等电点时沉淀效果更好。

常温下有机溶剂可使蛋白质变性，低温条件下可减慢变性速度。因此用有机溶剂沉淀蛋白质时应在低温条件下进行。如利用丙酮沉淀蛋白质时，必须在0～4℃低温下进行。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离，否则蛋白质会变性。

三氯乙酸(TCA)沉淀蛋白质主要基于以下几个方面的作用:①在酸性条件下TCA能与蛋白质形成不溶性盐;②TCA作为蛋白质变性剂使蛋白质构象发生改变，暴露出较多的疏水性基团，使之聚集沉淀。

【实验器材】

1．5 ml离心管、5 ml离心管、移液枪、冷冻高速离心机、冷冻干燥离心机等。

【药品试剂】

1．蛋白质溶液。

2．20%TCA。

3．丙酮。

4．PBS磷酸缓冲液。

【实验方法】

1．TCA沉淀法:

(1)取500μl蛋白溶液，加入等体积预冷的20%TCA溶液，立刻混匀。

(2)冰上放置30分钟。

(3)4℃，13200 r/min离心15分钟。

(4)小心去除上清液，冷冻干燥沉淀，约1小时。

(5)加入50μl PBS溶解沉淀，280 nm测定蛋白质浓度。2．丙酮沉淀法:

(1)在－20℃预冷丙酮溶液。

(2)500μl蛋白液放置于5 ml管中，加入3 ml预冷丙酮，迅速混匀，－20℃放置2小时以上或过夜。

(3)4℃，13200 r/min离心15分钟。

(4)小心弃去上清液，注意勿接触沉淀。加入100 ml冷的90%丙酮洗涤沉淀，4℃，13200 r/min离心5分钟。

(5)重复上一步再次洗涤沉淀。

(6)弃去上清液，空气中干燥沉淀15～30分钟。

(7)加入适量PBS溶解蛋白质沉淀。

【注意事项】

1．TCA沉淀法不适于大分子量蛋白质。因为随着蛋白质分子量的增大，其结构复杂性与致密性也增大，TCA可能渗入分子内部而使之较难被完全除去，在电泳前样品加热处理时可能使蛋白质结构发生酸水解而形成碎片，而且随时间的延长这一作用愈加明显。

2．含有TCA的蛋白质进行电泳时，会因为TCA的结合使SDS与蛋白质的结合量产生偏差，从而造成蛋白质所带电荷的不均一性，造成迁移率的不一致，从而导致蛋白质条带出现展宽现象。

3．用TCA法对小分子量蛋白质进行浓缩，样品处理后要尽快进行电泳分析，以免发生聚集及断裂，造成结果分析的不准确。

4．如果待浓缩的蛋白质含量过少，如小于几微克，可按每个样品10μg的量加入胰岛素作为辅助蛋白质帮助蛋白质沉淀浓缩。

5．丙酮沉淀法适合从大多数水相溶剂中或者混有SDS的缓冲液中抽提蛋白质，不适于抽提在尿素或胍类变性溶液中的蛋白质。

6．注意丙酮沉淀法需在丙酮不能溶解的容器中进行，如polypropylene。

7．TCA法和丙酮法可以结合使用，即先用TCA沉淀，然后用冷丙酮洗涤沉淀，抽提TCA。

【思考题】

试比较分析TCA法和丙酮法沉淀浓缩蛋白质的优缺点。