鲁米诺的化学发光

一、实验目的

（1）了解合成化学发光材料鲁米诺 （Luminol）。

（2）观察在不同条件下的化学发光现象，了解催化剂、酸度和温度对化学发光现象的影响。

（3）分析比较生物酶和金属离子对化学发光反应的催化效率。

二、实验原理

剧烈的化学反应常同时伴随有热和光的产生。光的产生通常和体系在高温时的辐射有关，往往温度不同，光色也不同。另有一类化学反应，可以通过分子的被激发 （由基态变为能量较高的激发态）和弛豫 （由激发态回到基态）将反应中释放的能量大部分变为光能，而体系的温度变化不大，这种现象叫做化学发光现象 （Chemiluminescence）。夏夜庭院中飞舞的萤火虫所发的光就其本质而言，也属于化学发光现象。化学发光现象已获得广泛的应用，除用作紧急光源、信号光源外，有关的反应已用于灵敏度极高的光化学分析中。

3－氨基邻苯二甲酰肼 （又称鲁米诺），是一种较强的化学发光物质，在中性溶液中通常以偶极离子 （两性离子）存在。在碱性溶液中，则变成二价负离子，并可被氧分子氧化成一种能产生化学发光现象的中间体。在氧化剂中，鲁米诺被转换为激发态，激发态衰变为基态并发出荧光，发光反应方程式见下面。

如溶液中混有适当的荧光染料，在鲁米诺本身发光之前，若鲁米诺中间体可将能量传递给染料，则可调整发光的颜色。

鲁米诺的合成是通过邻苯二甲酸酐硝化制得3－硝基邻苯二甲酸，随后与肼反应生成黄色的环状二酰胺，再经连二亚硫酸钠Na2S2O4还原得到鲁米诺。

由于时间关系，鲁米诺的合成只做最后一步。

三、仪器和试剂

1．仪器

试管 （20cm3，3支；10cm3，3支）、试管夹、油浴或酒精灯、烧杯 （100cm3，1个）、锥形瓶 （100cm3，2个）、量筒 （50cm3、10cm3各1个）、滴管2支、玻璃棒、台秤、80－2型离心沉淀机。

2．试剂

粒状Na OH、10％Na OH、10％H2O2、二甲亚砜、染料、铁氰化钾晶体、连二亚硫酸钠粉末、冰醋酸、浓H2SO4、0．1mol／dm3Na OH、0．1mol／dm3铁氰化钾、Tris缓冲液[1]、0．9％过氧化物酶。[2]

四、实验内容

1．鲁米诺的合成

在20cm3试管中，加入0．3g环状二酰胺，用5cm310％Na OH溶解，加入2g连二亚硫酸钠粉末，用玻璃棒充分搅匀，在通风柜内，将试管放入油浴中，加热至沸后，保温15min （或用酒精灯的微火小心加热至沸腾，试管距火焰高些，保温加热，并不断摇晃，千万不可喷出！沸腾15min），加入冰醋酸2cm3。将试管自然冷却至室温，再在冷水浴中冷却10min，逐渐析出棕黄色鲁米诺固体，离心分离，用滴管取出上层清液，得产物鲁米诺约0．3g。

2．化学发光实验 （在暗处观察）

（1）在100cm3锥形瓶底部铺上约10粒粒状Na OH，用玻璃棒蘸出1／3鲁米诺，并加8cm3二甲亚砜剧烈振荡，使空气溶入溶液中，在暗处可观察到蓝白色光辉。向上述体系中加入5cm310％H2O2后继续振荡，2～3min后可以看到发光强度很快增加。

（2）在100cm3烧杯中加入60cm3水，再加8粒Na OH、5cm310％的H2O2和1／3鲁米诺，将一小片滤纸放在溶液的表面，小心放上少量铁氰化钾晶体，仔细地摇动，让少量晶体掉入溶液，或沿烧杯壁轻轻撒入少量铁氰化钾晶体，观察发光现象，再加入3滴染料溶液，观察颜色的变化。

①将以上溶液部分倒入1支10cm3试管中，逐滴加入5～10滴浓H2SO4，观察酸度对化学化光的影响。

②再将以上溶液部分倒入两支10cm3试管中，分别放入冰 （冷）水及热水浴中对比观察，了解温度对化学发光现象的影响。

（3）在锥形瓶中，加入30cm30．1mol／dm3Na OH溶液和剩余的鲁米诺，滴加3滴10％H2O2后即可观察到微弱的发光。将上述体系均匀分入两支20cm3试管中，分别加入4滴铁氰化钾和过氧化物酶溶液，均可观察到持续几秒钟的强光发射，比较生物酶和金属离子对化学发光反应的催化效率。

五、思考题

（1）鲁米诺合成也是在碱性条件下进行，为什么生成的鲁米诺不会发光？

（2）试分析鲁米诺发光的影响因素？

（3）在生物体中，过氧化物可催化产生H2O2，试分析用化学发光测定过氧化物酶活性的原理。