酶标记化学发光法测

实验六　酶标记化学发光法测AFP

实验目的

（1）掌握酶标记化学发光法测AFP的实验原理。

（2）了解其操作方法。

实验原理

化学发光酶免疫分析（chemiluminescence enzyme immunoassay，CLEIA）是用参与催化某一化学发光反应的酶，如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（ALP）来标记抗原或抗体，在与待测标本中相应的抗原（抗体）发生免疫反应后，形成固相包被抗体－待测抗原－酶标记抗体双抗体夹心复合物，经洗涤后，加入底物（发光剂），酶催化和分解底物发光，由光量子阅读系统接收，光电倍增管将光信号转变为电信号并加以放大，再把它们传送至计算机数据处理系统，计算出测定物的浓度。

实验材料

（1）固相载体聚苯乙烯珠，抗AFP单克隆抗体（AFP－9，AFP－8），AMPPD，发光增强剂BDMQ。

（2）Berthold LB－9501发光仪、微量移液器。

实验方法

1．试剂制备

（1）固相抗体的制备　聚苯乙烯珠（0．5g/L）用抗AFP单克隆抗体AFP－9包被，然后置于含有单抗的磷酸缓冲液（50mmol/L）中，室温0．5～2h。再用含BSA 20g/L的0．1mol/L的Tris缓冲液于37℃封闭12～24h。

（2）酶标抗体制备　胃蛋白酶消化单抗AFP－8，制备抗体Fab′片段，然后用巯基乙胺还原Fab′片段，再用碱性磷酸酶和N－（γ－顺丁烯二酰亚胺丁酰氧酶）琥珀酰亚胺作用，Fab′片段铰链区巯基与碱性磷酸酶顺丁烯亚胺结合，凝胶过滤或离子交换层析纯化。

（3）标准校准　将0．1g/L的AFP稀释到1mg/L，每个标准AFP再用标准稀释剂稀释，用EIA和RIA校准标准。

2．测定

（1）血清样品或标准AFP 10μL和包被好的聚苯乙烯珠一起室温孵育30min。

（2）加入酶标抗体于37℃孵育30min。

（3）洗涤后加入AMPPD溶液，反应20min。

（4）用Berthold LB－9501发光仪测量5min。

（5）计数发光信号，以发光单位（RLU）表示，RLU相当于在Berthold发光仪上每5秒1 000计数。

实验结果

以系列标准AFP测得相应RLU，制备标准曲线。将测得样品的RLU在标准曲线上查到AFP含量。

思考题

（1）对于检测血清中的AFP，本实验方法与对流免疫电泳相比较是否灵敏度更高？请分析原因。

（2）简述血清AFP检测的临床意义。