酶学分析类型

酶学分析技术除用于测定酶活性外,还用于代谢物的分析,即用酶学分析法来测定人体内的代谢物或代谢产物浓度。酶学分析技术具有反应条件温和、安全、样品不需预处理可直接测定,其方法特异性和灵敏度高等特点,已被广泛用于体液中各种有机物测定,如葡萄糖、尿素、肌酐、胆固醇、三酰甘油等。

(一)单酶反应和酶偶联反应

在代谢物酶学分析技术中,分光光度法依然是最常用的测定手段。根据测定方法的原理不同,一般分为单酶反应和酶偶联反应两种技术。

单酶反应比较简单。一般将工具酶和待测底物一起保温,按定时法或连续监测法对待测底物进行测定,在相应的氧化还原酶作用下,产生可以直接检测的信号,如胆红素在胆红素氧化酶的作用下生成胆绿素,引起450nm处吸光度下降,从而检测出胆红素含量。

单酶反应测定项目较少。酶偶联法若不限制偶联酶的数量,不考虑酶的来源和价格,从理论上讲几乎可以测定所有代谢物,而且每种代谢物可以使用不同的酶建立多种检测方法,如三酰甘油、胆固醇等都有多种酶试剂法。指示反应主要分为NAD(P)H和过氧化物酶(POD)系统两类。

目前广泛使用的是酶偶联反应技术。在酶活性测定时,常采用另一个(指示酶)或几个酶(辅助酶和指示酶)将测定酶的某一产物转化为新的产物,当其他酶的反应速度与待测酶反应速度达到平衡时,可用指示酶的反应速度代表待测酶的活性,可以表示为。

E x为待测酶,E a为辅助酶,E i为指示酶,指示酶是指能监测反应速度的酶,辅助酶在酶偶联反应中可以一个或多个,也可以不需要辅助酶。由于NAD(P)+或NAD(P)H在340nm的光吸收特性,很容易进行连续监测,因此它是最常用的指示反应,过氧化物酶(POD)也可做指示酶。

酶偶联反应原理:用酶偶联法测定酶活性时,酶促反应进程存在4个时相:①预孵育期,使内源性底物(S)消耗殆尽,产生少量中间产物B;②延滞期,加入底物启动反应,开始时反应速度较慢,产生少量中间产物C,指示反应速率E i也较低,不能代表测定酶的反应速率E x;③线性反应期(恒态期),随产物B增加到一定程度,C的生成速度等于转化为D的速度,即E x和 E i催化的反应速率相同,反应达到平衡;④偏离线性期(非恒态期),反应后期,底物已大部分消耗,反应速度减慢,进入非恒态期。

应用酶偶联法测定时,关键在于确定线性反应期,因为只有线性反应期才代表酶活性。只有此阶段的吸光度才会有明显的线性变化。酶偶联反应各期吸光度的变化见图4-3。线性反应期可以通过测定指示酶的V m和K m等动力学参数计算确定。

图4-3　酶偶联反应各期吸光度的变化

(二)常用的指示系统

1.以NAD(P)+或NAD(P)H为辅酶的脱氢酶类作为指示酶,监测其反应物NAD(P)H于340nm处紫外吸收或在紫外激发光365nm波长照射下,在460nm发射强烈荧光变化速率的测定系统。

2.偶联过氧化氢(H 2 O2)是以过氧化物酶(POD)为指示酶的测定系统。临床用酶偶联方法测定的常用酶见表4-1。

表4-1　用酶偶联方法测定的常用待测酶

*LDH并不是真正意义上的辅助酶

(三)底物浓度的测定

无论是定时法还是连续监测法,都要通过测定底物或产物来实现。根据酶促反应中任一底物或产物有特征性的物理化学特性(如颜色、浊度、吸光度等),设计了一些检测装置。常用的检测装置有分光光度计、浊度计、电位滴定仪、生物传感器等。