血清脂蛋白测定

血清脂蛋白测定_生物化学实验技术

实验项目八　血清脂蛋白测定

学习目标

【知识目标】

（1）能够迅速而准确地描述血清HDL－c、LDL－c浓度检测的操作要点。

（2）能用自己的语言描述检测HDL－c、LDL－c浓度的相应原理。

【能力目标】

（1）能够判断HDL－c、LDL－c浓度的异常，并能说明相关临床意义。

（2）能在规定时间内正确完成HDL－c、LDL－c浓度检测各项操作内容，做到步骤正确、动作连贯协调、内容全面无遗漏。

（3）能够结合血清HDL－c、LDL－c浓度检测结果及总胆固醇、甘油三酯浓度检测结果综合分析高脂蛋白血症，并进行分型。

案例引导

某患者的空腹静脉血标本检查结果如下：血清外观混浊，4℃条件下过夜后血清外观仍混浊，液面有“奶油样”上层，甘油三酯浓度为3.89mmol/L，胆固醇浓度为4.91mmol/L，HDL－c浓度为1.45mmol/L，LDL－c浓度为7.3mmol/L，前β－脂蛋白浓度升高，β－脂蛋白浓度正常，乳糜微粒呈阴性，请初步诊断为何种病。

（提示：高脂蛋白血症）

一、高密度脂蛋白测定

血浆中的脂蛋白有多种类型，测定其各自的含量对于了解机体正常及疾病过程中脂质代谢状况有重要的临床意义。按照超速离心法可将血浆脂蛋白分为乳糜微粒（CM）、极低密度脂蛋白（VLDL）、低密度脂蛋白（LDL）及高密度脂蛋白（HDL）四类，其中高密度脂蛋白负责将外周组织中的胆固醇反转运入肝脏。然后，胆固醇转化为胆汁酸，通过胆道进入肠道。HDL是一组不均匀的脂蛋白颗粒，在HDL中既有蛋白质又有胆固醇，还有磷脂复合体，故较难定量。由于其中胆固醇含量比较稳定，因此目前多以测定高密度脂蛋白中胆固醇总量的方法作为高密度脂蛋白定量的方法，也称为高密度脂蛋白－胆固醇（HDL－c）。要测定血清中HDL－c含量需先沉淀HDL以外的脂蛋白，即VLDL和LDL、CM。能使血清中VLDL和LDL沉淀的试剂很多，常用的有磷钨酸－镁沉淀法，其操作简便易行，结果准确，是目前临床推荐使用的方法。近年来，HDL－c测定方法发展很快，从各种沉淀法已发展到化学修饰法、酶修饰法、化学清除法等多种方法，如PEG修饰酶法（PEG法）。

（一）磷钨酸－镁沉淀法

【实验原理】

用大分子聚阴离子（磷钨酸盐）和二价阳离子（镁离子）沉淀血清中含apoB的脂蛋白（LDL、VLDL和α－脂蛋白），离心后上清液中只含有高密度脂蛋白，可利用酶法测定其中的胆固醇含量，先用胆固醇酯水解酶将其转变为游离胆固醇，再在胆固醇氧化酶的氧化作用下生成Δ4－胆甾烯酮和过氧化氢，过氧化氢在4－氨基安替吡啉和4－氯酚作用下，经过氧化物酶催化，反应生成苯醌亚胺红色化合物，其颜色深浅与标本中的胆固醇含量呈正比。因此，将血清样本与同样处理的标准液进行比色，即可求出HDL－c的含量。

【实验器材】

分光光度计（或半自动生化分析仪），离心机，恒温水浴箱，试管，试管架，微量加样器。

【药品及试剂】

（1）新鲜血清。

（2）商品试剂盒供应，其主要成分与实验浓度如表3－13所示。

表3－13　磷钨酸－镁沉淀法检测HDL－c某试剂盒的主要成分与实验浓度

【试剂配制】

现在多用现成的试剂盒，方便、实用，既适用于手工操作，也适用于自动分析仪。

操作流程

【操作步骤】

1.工作液配制

将血清与沉淀剂R₃以1∶1混合，室温下放置10min后，以3000r/min的转速离心15min，取上清液做胆固醇测定，整个过程必须在4h内完成。取一定量R₂（参看R₁瓶签）复溶1瓶R₁，溶解后即为工作液。

2.显色反应

取干净试管3支，编号，按表3－14磷钨酸－镁沉淀法检测HDL－c的步骤进行操作。

表3－14　磷钨酸－镁沉淀法检测HDL－c操作步骤（单位：mL）

3.比色测定

将溶液分别混合均匀，在37℃条件下保温6min，以空白管调零，在500nm处有最大吸收峰，终点法，利用分光光度计（或半自动生化分析仪）测定A_标准及A_样品或浓度值。

【实验数据处理及结果分析】

如读取吸光度值A，则

【注意事项】

（1）血清在室温条件下，各类型脂蛋白之间会发生脂质交换，游离的胆固醇也会不断酯化，所以要及时测定，否则应冰冻保存。

（2）在离心过程中应该防止温度升高使沉淀不完全，室温应在15～25℃之间，且离心后应立即吸取上清液进行测定，否则结果会偏高。

（3）血清严重混浊时，可以将血清以生理盐水1∶1稀释后再沉淀，测定值乘以稀释倍数即为实际值。

（4）试剂内含叠氮钠，应避免直接接触皮肤和眼睛，切勿吞服。

（二）PEG修饰酶法（PEG法）

【实验原理】

在Mg^2＋的存在下，α－环糊精硫酸盐与CM、VLDL、LDL形成可溶性复合物。这些复合物具有能抵抗变构酶的作用；PEG6000或葡聚糖右旋糖苷与CEH和COD共价结合，从而引起酶的变构，变构酶对脂蛋白的大小和/或电荷具有选择性，其顺序依次为LDL＜VLDL≈CM＜HDL。而α－环糊精硫酸盐能限制CM、VLDL颗粒进入环状的环糊精结构，从而避免酶的催化作用，这种作用还与Mg^2＋浓度有关。其反应如下：

苯醌亚胺为红色化合物，其颜色深浅与标本中的胆固醇含量呈正比。因此，将血清样本与同样处理的标准液进行比色，即可求出HDL－c的含量。

【实验器材】

半自动生化分析仪，离心机，恒温水浴箱，试管，试管架，微量加样器。

【药品及试剂】

新鲜血清，试剂1（R₁），试剂2（R₂）。

【试剂配制】

1.试剂1（R₁）

3－（N－吗啉丙磺酸）（MOPS）缓冲液30mmol/L，pH值为7.0；α－环状葡聚糖硫酸盐0.5mmol/L；硫酸葡聚糖0.5g/L；MgCl₂2mmol/L；N－乙基－N－（3－甲基苯基）－N－琥珀酰乙二胺（EMSE）0.3g/L。

2.试剂2（R₂）

MOPS缓冲液30mmol/L，pH值为7.0；PEG修饰胆固醇酯水解酶1.0U/L；PEG修饰胆固醇氧化酶5.0kU/L；辣根过氧化物酶30kU/L；4－氨基安替吡啉0.5 g/L。

操作流程

【操作步骤】

1.半自动生化分析仪设置

根据各实验室仪器的型号及操作说明书进行半自动生化分析仪的设置。

设置步骤为参数设置→反应液准备→校准→质控。

参数设置如表3－15所示。

表3－15　PEG－酶法检测HDL－c参数设置

测定方法：两点终点法。

2.显色反应及比色测定

取干净试管3支，编号，按表3－16PEG－酶法检测HDL－c操作步骤进行操作。

表3－16　PEG－酶法检测HDL－c操作步骤（单位：mL）

续表

【实验数据处理及结果分析】

【实验意义】

1.正常值（建议各实验室建立自己的参考范围）

男：成人，1.16～1.42mmol/L。

女：成人，1.29～1.55mmol/L。

2.意义

HDL是一种抗动脉粥样硬化的脂蛋白，是冠心病的保护因素。经流行病学研究表明，高密度脂蛋白（HDL－c）与冠心病呈负相关，HDL－c浓度小于0.9mmol/L是冠心病的危险因素，HDL－c浓度升高被认为是冠心病的“负”危险因素。所以，监测血清中的HDL－c的浓度非常重要。HDL－c有助于防止罹患冠心病，而HDL－c浓度降低，尤其伴有甘油三酯浓度升高时，会增加心血管疾病的危险。

（1）HDL－c浓度降低多见于急性感染，糖尿病，慢性肾功能衰竭，肾病综合征，心、脑血管病，肝炎，肝硬化等疾病。

（2）HDL－c浓度过高，也属于病理状态，常被定义为高HDL血症，可分为原发性和继发性两类。原发性高HDL－c血症的病因可能有胆固醇酯转移蛋白（CETP）缺损、肝脂酶（HL）活性降低或其他不明原因。继发性高HDL－c血症的病因可能有运动失调、饮酒过量、慢性中毒性疾病、长时间的需氧代谢、原发性胆汁性肝硬化、治疗高脂血症的药物引起及其他不明原因。

二、低密度脂蛋白测定

【实验原理】

低密度脂蛋白（LDL）是富含胆固醇的脂蛋白，是动脉粥样硬化的危险性因素。LDL经过化学修饰后，其中的apoB－100变性，通过清道夫受体被吞噬细胞摄取，形成泡沫细胞并停留在血管壁内，导致大量胆固醇沉积，促使动脉壁形成动脉粥样硬化斑块，故LDL为致动脉粥样硬化的主要脂类危险因子。通过测定低密度脂蛋白－胆固醇（LDL－c）浓度反映LDL的水平。目前，常用LDL－c代替总胆固醇（TC）作为冠心病危险因素指标。常见的血清LDL－c浓度测定方法有增溶法、表面活性剂法（SUR法）、保护法、过氧化氢酶法等。

本实验采用的表面活性剂法是国内外目前使用最广泛的一种方法。标本中加入的第一种表面活性剂，使得除LDL－c以外的其他的脂蛋白结构被破坏，所释放出来的微粒化胆固醇分子与胆固醇酶试剂反应，产生的H₂O₂在缺乏偶联剂时被消耗而不显色，此时LDL颗粒仍是完整的。加入第二种试剂，LDL－c的结构被第二种试剂中的表面活性剂破坏，使得LDL颗粒解离释放胆固醇，释放出的胆固醇与酶及显色液反应，生成红色产物。因其他脂蛋白的胆固醇分子已除去，故生成颜色的深浅与低密度脂蛋白－胆固醇LDL－c浓度呈正比，从而能测定LDL－c的浓度。其主要反应如下：

VLDL、CM和HDL＋表面活性剂Ⅰ＋CEH和→─CODΔ4－胆甾烯酮＋H₂O₂

【实验器材】

半自动生化分析仪，离心机，恒温水浴箱，试管，试管架，微量加样器。

【药品及试剂】

新鲜血清，试剂1（R₁），试剂2（R₂）。

【试剂配制】

1.试剂1（R₁）

胆固醇氧化酶1000U/L，苯酚28.0mmol/L，胆固醇酯水解酶2000U/L，过氧化氢酶1000kU/L，NaN₃4.5g/L，表面活性剂Ⅰ适量。

2.试剂2（R₂）

4－氨基安替吡啉0.5mmol/L、过氧化物酶8000U/L、表面活性剂Ⅱ适量。

操作流程

【操作步骤】

1.半自动生化分析仪设置

根据各实验室仪器的型号及操作说明书进行半自动生化分析仪设置。

设置步骤为参数设置→反应液准备→校准→质控。

参数设置如表3－17所示。

表3－17　SUR法检测LDL－c参数设置

测定方法：两点终点法。

2.显色反应及比色测定

取干净试管3支，标记，按表3－18SUR法检测LDL－c手工操作步骤进行操作。

表3－18　SUR法检测LDL－c手工操作步骤（单位：mL）

【实验数据处理及结果分析】

【实验意义】

1.正常值

正常LDL－c浓度为3.1～3.6mmol/L（建议各实验室建立自己的参考范围）。

2.意义

LDL－c浓度的测定与总胆固醇一样，是临床上诊断冠状动脉粥样硬化的重要指标。该指标增高提示心肌梗死的危险性增大。ATPⅡ以总胆固醇作为高血液胆固醇的分类和治疗标准，是因为在Framingham建立的数据中，TC与危险的相关性更强。

ATPⅢ中将高血液胆固醇分成5个等级，但美国胆固醇教育计划（NCEP）非正式的意见是患者的治疗仍以三个分类为基础。

血清LDL－c水平随年龄增加而升高。高脂、高热量饮食，运动少和精神紧张等也可使LDL－c水平升高。LDL－c水平升高还可见于家族性高胆固醇血症、家族性apoB缺陷症、混合性高脂血症、糖尿病、甲状腺功能低下、肾病综合征、梗阻性黄疸、慢性肾功能衰竭、Cushing’s综合征、妊娠、多发性肌瘤等。

LDL－c水平降低可见于家族性无β－脂蛋白或低β－脂蛋白血症、营养不良、甲状腺功能亢进、消化吸收不良、肝硬化、慢性消耗性疾病、恶性肿瘤、apoB合成减少等。

能力检测

一、单项选择题

1.下列哪种脂蛋白具有抗动脉粥样硬化作用？（　　）

A.LDL　B.HDL　C.CM　D.VLDL　E.FFA

2.LDL中含量最多的物质是（　　）。

A.蛋白质　B.甘油三酯　C.胆固醇　D.磷脂　E.游离脂肪酸

3.高脂蛋白血症Ⅱa患者血中（　　）。

A.CM增高　B.甘油三酯增高　C.VLDL和胆固醇增高

D.LDL和胆固醇增高　　　　　E.VLDL和甘油三酯增高

4.HDL－c低于多少是冠心病的危险因素？（　　）

A.0.9mmol/L　B.1.0mmol/L　C.0.8mmol/L

D.1.4mmol/L　E.1.6mmol/L

5.若LDL及VLDL同时升高则可诊断为（　　）。

A.高脂蛋白血症Ⅰ　　B.高脂蛋白血症Ⅱa　　C.高脂蛋白血症Ⅱb

D.高脂蛋白血症Ⅳ　　E.高脂蛋白血症Ⅴ