比色法测定土壤腐植酸组分的研究

比色法测定土壤腐植酸组分的研究_2011年论文集

杨俐苹 白由路 王向阳 王 磊 王 贺

（农业部作物营养与施肥重点实验室 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所 北京 100081）

摘 要：选择我国有代表性的黑土、红壤、潮土，研究了应用比色法测定土壤腐殖质组分方法。结果显示比色法测定腐植酸、富里酸和胡敏酸含量与常规重铬酸钾容量法测定结果成显著相关，其直线回归的复相关系数R2分别为：0.9529、0.7049和0.8845。在黑土、红壤上无论腐植酸、富里酸和胡敏酸比色法与容量法皆成显著相关，且相关系数高。但在潮土上，只有腐植酸两种测定方法结果相关性达到1%显著水平，可见在有机质含量较低的潮土上，应用比色法测定土壤腐殖质组分的方法需要进一步研究。此外，应用比色法测定土壤腐殖质组分最好选择同一类型的土壤提取的腐植酸、胡敏酸和富里酸做标准系列以提高估测的准确性。

关键词：腐植酸 胡敏酸 富里酸 土壤腐殖质 测定方法

Study on the Colorimetric Method of Extracted Soil Humic Substances

Yang Liping, Bai Youlu, Wang Xiangyang, Wang Lei, Wang He

( Ministry of Agriculture Key Laboratory of Crop Nutrition and Fertilization, Institute of Agricultural Resources and

Regional Planning, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing, 100081)

Abstract: The colorimetric method of extracted soil humic substances was studied on the three types of soil including black soil, red soil and fluvo-aquic soil. It showed there were significant correlations of the colorimetric method with wet oxidation followed by titration method for total extracted soil humic substances, fulvic acid and humic acid which the multiple correlation coefficients (R2) by 0.9529, 0.7049 and 0.8845. The correlation coefficients of two methods were very high in black soil and red soil but the correlation between two methods only for extracted soil humic substance reached at the 1 % significant level in fluvo-aquic soil. It indicated application of colorimetric method in fluvoaquic soil for fulvic acid and humic acid need more research when it put into practice as low organic matter. It has better using the same type of soil with high SOM for standard matters when the colorimetric method was applied in measurement of total extracted soil humic substance, fulvic acid and humic acid for improving the precision of estimation.

Key words:soil humus; humic substance; fulvic acid; humic acid; measure method

土壤有机质含量是土壤肥力高低的重要指标之一。土壤腐殖质是土壤有机质的主要组成部分。土壤腐殖质的组成及性质变化研究历来为人们所重视，因为研究腐殖质组分的变化更能表征土壤肥力水平和演变状况[1～4]。土壤腐殖质由胡敏酸、富里酸、胡敏素等组成，土壤腐殖质的分组测定通常采用0.1 mol/L焦磷酸钠和0.1 mol/L氢氧化钠混合液提取腐植酸(胡敏酸、富里酸)[5]，在此条件下，能将土壤中的难溶于水和易溶于水的结合态的腐殖质络合成易溶于水的腐殖质钠盐，从而比较完全地将腐植酸提取出来。同时将腐植酸浸提溶液用酸将胡敏酸沉降出来，再将沉淀用氢氧化钠溶解成为胡敏酸钠盐，腐植酸、胡敏酸的有机碳量一般用重铬酸钾容量法测定[5]。富里酸含量可由腐植酸含量减去胡敏酸含量计算。重铬酸钾容量法测定腐植酸中有机碳量对温度、时间等氧化条件要求严格，操作繁琐，测定时间长，且有对环境有害的铬离子污染。

土壤腐植酸为棕褐色，在一定的浓度范围内，腐植酸颜色深浅与其含量成正相关。因此可以用分光光度法直接测定土壤腐植酸含量以及胡敏酸和富里酸的含量。采用比色法测定腐殖质组分，操作简便，实验步骤容易掌握，测定的灵敏度和准确度高，干扰少，而且可以节约油料、能源、时间以及减少环境污染和消除实验中的安全隐患。尽管对腐植酸及其组分的研究已经发展到采用现代技术如元素分析仪、红外光谱测试等技术手段分析腐植酸含量及组分的结构组成[2]，但对土壤腐殖质分组最基本的研究采用简单快速的研究手段，仍然是土壤肥力研究以及土壤腐殖质测试方法研究改进需要探索的内容。本研究将腐植酸测定的比色分析结果与经典的重铬酸钾热容量法测定结果加以比较，以期在实践中能够推广应用。比色法测定土壤腐殖质组分是土壤测试新方法的尝试。

1 材料与方法

1.1 供试土壤

供试土壤来源于中国农业科学院国家测土施肥中心实验室，黑土取自吉林和黑龙江，红壤取自湖南、湖北和江西，潮土取自河南和河北，土样风干过60目筛。

1.2 主要仪器和试剂

主要仪器：分光光度计、恒温震荡器、恒温箱、油浴锅。

主要试剂：(1) 腐植酸提取剂：C(Na4P2O7)= 0.1 mol/L，C(NaOH)=0.1 mol/L；(2) 中和酸采用0.5 mol/L的H2SO4溶液；(3) 中和碱用1.0 mol/ L NaOH；(4) 0.025 mol/L H2SO4溶液；(5) 0.05 mol/L NaOH溶液；(6) 0.20 mol/L FeSO4溶液；(7) 0.4000 mol/L重铬酸钾溶液；(8) 邻啡啰琳指示剂；(9) 浓硫酸(比重1.84，分析纯)。

1.3 实验方法

1.3.1 腐植酸、富里酸和胡敏酸比色法测定标准溶液的制备及浓度的标定

(1) 标准溶液的制备[6]。

称量50 g有代表性并富含腐殖质土壤样品于500 mL三角瓶中，加入250 mL腐植酸提取剂，震荡1 h，在20～25 ℃室温静置过夜，虹吸瓶中上部清液于烧杯中，一份不分离作为腐植酸的标准溶液，转入塑料瓶中，放入温度小于5 ℃冰箱中保存。

另一份加中和酸滴定至pH=3.0(pH计检验)，记录所用中和酸体积，加盖密封，置于80 ℃恒温箱中保温30 min，静置过夜。用慢速滤纸过滤于烧杯中，在滤液中再加入与前所耗中和酸等体积的中和碱(加碱以利于富里酸溶液的保存)，转入塑料瓶中，放入温度小于5 ℃冰箱中保存。此即作为富里酸(FA)的标准溶液。

将滤纸及其上残渣连同漏斗转入三角瓶上，用0.025 mol/L H2SO4洗涤至滤液无色，弃去滤液(目的是洗净滤纸及残渣上残留的富里酸溶液)，将滤纸、残渣连同漏斗放到另一三角瓶上。以刚沸腾的0.05 mol/L NaOH溶液洗涤至滤液基本无色，冷却后储于塑料瓶中，放入温度小于5 ℃冰箱中保存。此即作为胡敏酸(HA)的标准溶液。

(2) 胡敏酸(HA)、富里酸(FA)标准溶液浓度的标定。

分别取上述制备的腐植酸、富里酸和胡敏酸标液2～10 mL(视颜色深浅而定)于50 mL三角瓶中, 调节酸度为中性。在60 ℃的恒温水浴中蒸干，然后加5mL重铬酸钾再加入5 mL的浓硫酸(1.84 g/L)，摇匀，加弯管漏斗做回流装置，同时做空白，在170～180 ℃的油浴中，溶液沸腾开始记时5 min后取出。冷却后转入250 mL的三角瓶中，用0.2 mol/L FeSO4滴定剩余的重铬酸钾。求出腐植酸、富里酸和胡敏酸标液的浓度(有机碳量)。根据腐植酸、富里酸和胡敏酸标液的浓度再准确稀释配成如下标准系列：

(a) 腐植酸系列标准溶液浓度分别为：0、10.0 μg/mL、20.0 μg/mL、30.0 μg/mL、40.0 μg/mL、50.0 μg/mL；

(b) 富里酸和胡敏酸系列标准溶液分别是：0、20.0 μg/mL、40.0 μg/mL、60.0 μg/ mL、80.0 μg/mL、100 μg/mL。

1.3.2 土壤样品腐植酸的浸提与分离[5]：

称重5g试样于250 mL三角瓶中，加入100 mL腐殖质提取剂，振荡30 min，在20～25 ℃室温静置13～14 h。然后摇匀，以慢速滤纸过滤(弃取数毫升初始滤液)。滤液即为腐植酸试液。

吸取腐植酸浸提的试液20 mL于50 mL烧杯中，搅拌下滴加中和酸V(mL)至pH=3.0(pH试纸检验)，然后置于80 ℃恒温干燥箱里，保温30 min，静置过夜。第二天将溶液用慢速滤纸过滤于100 mL容量瓶中，用0.025 mol/L H2SO4洗涤至滤液无色，滤液中再加中和碱V(mL)(加碱以利于富里酸的保存)，用腐植酸提取剂定容至刻度，摇匀得到含富里酸的试液。

将滤纸、沉淀连同漏斗转至另一100 mL容量瓶上，用刚沸腾的0.05 mol/L NaOH溶液少量多次洗涤至滤液和滤纸无色，放置至室温，用0.05 mol/L NaOH溶液定容至刻度，摇匀得到含胡敏酸试液。

1.3.3 容量法测定腐植酸、富里酸和胡敏酸[5，7]

分别吸取腐植酸、富里酸和胡敏酸溶液各5～50 mL(视有颜色深浅而定)于100 mL三角瓶中, 调节酸度为中性。在60 ℃的恒温水浴中蒸干，然后加5 mL重铬酸钾溶液再加入5 mL浓硫酸，摇匀，加弯管漏斗做回流装置，同时做空白，然后放入170～180 ℃的油浴中，溶液沸腾开始记时，5 min后取出。冷却后转入到250 mL的三角瓶中，并用0.2 mol/L FeSO4滴定剩余的重铬酸钾,根据滴定体积计算腐植酸、富里酸和胡敏酸溶液的浓度。

1.3.4腐植酸、富里酸和胡敏酸溶液的比色测定

用制备的腐植酸、富里酸和胡敏酸标准系列溶液做标准，在460 nm的波长下比色测定土样腐植酸、富里酸和胡敏酸吸光度，根据标准曲线计算样品溶液腐植酸、富里酸、胡敏酸浓度并计算土壤腐植酸、富里酸和胡敏酸含量。若测定时吸光度过高，可将标准溶液和样品稀释后再测定。

2 结果与分析

2.1 腐植酸、富里酸和胡敏酸比色法测定标准系列制备及标准溶液浓度曲线研究

实验选择有代表性的、有机质含量较高的土样提取腐植酸并作为分离富里酸(FA)、胡敏酸(HA)标准样品的材料。选择的土壤为黑土，取自黑龙江宝清县，土壤pH5.9,有机质含量4.56%，用腐植酸提取剂(0.1 mol/L的Na4P2O7加入0.1 mol/L的NaOH配置而成)提取腐植酸并分离得到富里酸、胡敏酸溶液，再用重铬酸钾氧化-容量法测定腐植酸、富里酸和胡敏酸的有机碳含量，根据制备的腐植酸、富里酸、胡敏酸标样有机碳含量准确稀释分别得到标准系列。

在分光光度计上460nm处测定各组分各浓度的吸光度，制作腐植酸、富里酸和胡敏酸标准溶液系列曲线见图1～图3。

图1 腐植酸标准溶液系列曲线
Fig.1 Standard curve of soluble humus

图2 富里酸(FA)标准溶液系列曲线
Fig.2 Standard curve of fluvic acid

图3 胡敏酸(HA)标准溶液系列曲线
Fig.3 Standard curve of humic acid

结果显示，腐植酸浓度与吸光度(A)复相关系数R2为0.9997,直线回归方程为：y(μg/ mL)=81.28A-0.2644；富里酸(FA)浓度与吸光度(A)复相关系数R2为0.9995,直线回归方程为：y(μg/mL)=298.1A-0.0318；胡敏酸(HA)浓度与吸光度(A)复相关系数R2为0.9997,直线回归方程为：y(μg/mL)=58.928 A-0.4522。

2.2 不同土壤腐植酸、富里酸和胡敏酸比色结果与容量法结果的相关性

根据建立的腐植酸、富里酸和胡敏酸标准溶液系列曲线，用比色法测定并计算了40个土壤样品包括黑土、红壤和潮土提取的腐植酸、富里酸和胡敏酸含量。同时用重铬酸钾-容量法测定所有供试土样的腐植酸、富里酸和胡敏酸含量，比较两种方法在不同土壤类型上的相关性和差异性。见图4～图6。

图4 腐植酸比色法测定结果与容量法测定结果相关性
Fig.4 Correlation of the extracted soil humic substance measured by colorimetric method with titrimetric method

图5 富里酸(FA)的比色法测定结果与容量法测定结果相关性
Fig.5 Correlation of the FA measured by colorimetrric method with titrimetric method

图6 胡敏酸(HA)的比色法测定结果与容量法测定结果相关性
Fig.6 Correlation of the HA measured by colorimetric method with titrimetric method

结果显示，比色法测定腐植酸含量和容量法测定腐植酸含量成显著相关(图4)，复相关系数R2 =0.9529，相关回归直线方程为：y=0.9508x+1.0123；富里酸比色法测定和容量法测定成显著相关(图5)，复相关系数R2=0.7049，相关回归直线方程为：y=0.6166x+1.2684；胡敏酸比色法测定和容量法测定成显著相关(图6)，复相关系数R2=0.8845，相关回归直线方程为：y=0.8121x+2.2393。可见比色法测定和容量法测定相关显著性腐植酸>胡敏酸>富里酸。

按不同土壤类型分别分析腐植酸、富里酸和胡敏酸比色法与容量法结果相关性见表1。

表1 三种类型土壤上腐植酸、富里酸和胡敏酸比色法与容量法结果相关性差异
Tab.1 Correlation coefficients of two methods in three types of soil

注：**为1%显著性，*为5%显著性。

在黑土和红壤上，无论腐植酸、富里酸和胡敏酸比色法与容量法皆成显著相关，且相关系数高。说明在这两类土壤上，用简便、快速的比色法估测土壤腐植酸、富里酸和胡敏酸（下转173页）（上接97页）的含量是可行的。但在潮土上，除了腐植酸两种测定方法结果达到1%显著相关外，富里酸两种测定方法结果仅达到5%显著相关，而胡敏酸两种方法相关系数低于5%显著水平。

3 结论与讨论

(1) 腐植酸、胡敏酸和富里酸在460 nm处的比色结果与重铬酸钾容量法有很好相关性。通过比色法可以简便、快速、准确估测土壤腐殖质(酸)含量、组成，对于土壤肥力研究和评价有着重要意义，因为了解土壤腐殖质组成、演变，是土壤肥力研究和评价的重要内容。同时比色法测定土壤腐植酸组分为高效土壤测试技术开拓了新方法。

(2) 用分光光度计比色方法测定腐植酸含量，标准样品的选择非常重要。由于每一类土壤胡敏酸和富里酸各自具有基本相同的组成，不同土壤类型胡敏酸和富里酸含量存在差异，不同类型土壤腐殖质组成和性质不同，而同一地带的土壤腐殖质组成和性质可因土壤母质的不同也可能表现不同。因此，选择参比土样提取分离腐植酸、胡敏酸和富里酸建立标准系列时，除了选择有机质含量相对较高的土壤外，最好选用与研究对象同一类型的土壤提取的腐植酸、胡敏酸和富里酸做标准样品制作标准溶液系列曲线，以消除不同土壤HA/FA差异给测定结果带来的影响，提高估测的准确性。

(3) 比色法测定土壤腐植酸组分应用于有机质含量相对较高的土壤上更为合适。实验结果显示在黑土、红壤上无论腐植酸、富里酸和胡敏酸比色法与容量法皆成显著相关，且相关系数较大。但在潮土上，只有腐植酸两种测定方法结果相关性达到1%显著水平，可见在有机质含量较低的潮土上，应用比色法测定土壤腐植酸组分应慎重，由于潮土有机质含量较低，提取出来的腐植酸含量也较低，比色法的测定误差加大，可能是降低其相关性的原因之一，因此需要进一步研究比色法测定腐植酸组分的条件。

参考文献

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