腐植酸药理药效的研究进展

对上述作为药源的腐植酸，除了在纯度、分子/准分子级别上满足药用原料的质量外，还应加强药理-药效的研究工作。

生物酶属于蛋白质(HOOC-R-CH2NH2)，它是构成植物细胞原生质的基本组分。蛋白质的单体主要是脂族氨基酸，也有少量芳香族氨基酸，如色氨酸、组氨酸等。氨基酸通过肽键(-NHCO-)、硫醚键(-S-S-)、脒键 (-N=C-)，酯键、氢键连接起来。蛋白质有碱性基团(-NH2)和酸性基团(COOH)，是亲水性很强的胶体物质。在需氧条件下，蛋白质可水解成氨基酸、卟啉等氮化物。在厌氧条件下不完全分解，生成不同的多肽，其结构中含有NH、COOH、OH、SH等基团，也是参与HA形成过程的组成部分[1]。HA中的氮、硫及其酶-联反应与蛋白质的含量有关。

MTT是化学名为3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide, 商品名为噻唑蓝的一种能接受氢原子的染料。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物并沉淀在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的蓝紫色结晶物，用492 nm波长处测定其吸收值(OD)，可间接反映活细胞数量，从而反映受试药物对淋巴细胞的增值的影响。

樊兴明等利用MTT实验测定腐植酸对HELA细胞(癌细胞)的抑制作用(图1)。即：将对数生长期HELA细胞稀释到2×105个/毫升接种于96孔培养板，每孔接0.1　mL。分别加入不同浓度的腐植酸药物，每浓度平行5孔，空白对照组加等量体积的培养液。置温度35 ℃，5% CO2及饱和湿度的培养箱培养24 h。实验终止前4h取出细胞培养板，先在倒置显微镜下观察，然后在每孔中补充MTT工作液20 μL，终浓度0.5　g/L。培养结束后，采用离心2000 rpm×10 min，用微量加样器小心地吸弃上清，再加入100 μlDMSO，振荡10 min。待MTT还原产物完全溶解，在酶标仪上以492 nm为检测波长，630 nm为参考波长测定光密度值(OD值)。计算细胞的存活率，并以药物的不同浓度和细胞的存活率作图。

细胞存活率＝[试验组OD平均值]/[空白对照组OD平均值]×100%

半数抑制浓度(IC50)：引起半数细胞死亡的药物浓度。

图1中腐植酸MTT实验结果显示，其对HELA细胞的存活率为72.35%时，浓度为500 μg/mL，其抑制活性明显优于文献。而从图2Wei-Jiunn Lee等[18]的结果可以看出，加长腐植酸药物的作用时间，从24 h延长到48 h，也会大大提高腐植酸对癌细胞的抑制活性。

图1　不同腐植酸活性组分对HELA细胞的抑制效果
Fig.1　Inhibition effect of different active components by humic acid on HELA cells

图2　腐植酸对细胞存活率的影响
Fig.2　Effect of humic acid on cells viability

上图2的实验方法是：将细胞置于不同浓度的腐植酸中48h，并利用MTT法测定细胞的存活率。相对于未经处理的控制细胞，可以得出细胞存活率的值。在显著性检验因子p<0.05条件下对比添加腐植酸的控制细胞存活率；同时，在显著性检验因子p<0.05的条件下，对比不加腐植酸与加腐植酸的细胞存活情况进行比较[19～20], 得出的规律如图2所示.可以看出,在同样的500μg/mL浓度下, 对HELA细胞的存活率高于图1。

腐植酸及活性组分的药理作用情况如下。

(1)腐植酸类有机酸杀菌作用取决于未电离的分子，它透过细菌的细胞膜对细菌起杀灭作用。

(2)腐植酸有花生四烯酸(C20四烯酸)的抗菌、消炎等作用。

(3)腐植酸中的萜类，通过微生物细胞膜，干扰了能量代谢的酶促反应，影响其能量代谢途径来达到抗菌效果。

(4)腐植酸中脂溶性的甾类，容易穿透细胞膜进入细胞体内，干扰细胞膜的通透性，引起细胞凋亡或死亡,影响免疫系统。

(5)生化腐植酸的醇、酚羟基数目较多，在清除脂质过氧化产生自由基的同时，抑菌作用有所增强，半衰期约1小时,＜0.1　g,符合一级动力学。

(6)腐植酸中的酚羟基可与蛋白质分子中的氨基或羧基结合，其疏水的苯环结构也可与蛋白质发生疏水结合，腐植酸与蛋白质之间的多点结合作用，阻止了细菌的侵染，使其具有抑菌性。