分枝杆菌菌种鉴定芯片

1995年，Stanford大学Brown等发明了第一块以玻璃为载体的基因微矩阵芯片，标志着基因芯片技术进入了广泛研究和应用的时期。鉴于生物芯片技术领域的飞速发展，美国科学促进会将生物芯片评为1998年的十大科技突破之一。

一、生物芯片和基因芯片的基本概念

生物芯片技术是通过缩微技术，根据分子间特异性地相互作用的原理，又将生命科学领域中不连续的分析过程集成于硅芯片或玻璃芯片表面的微型生物化学分析系统，以实现对细胞、蛋白质、基因及其他生物组分的准确、快速、大信息量的检测。由于常用硅芯片作为固相支持物，而且在制备过程中运用了计算机芯片的制备技术，因此称之为生物芯片技术。生物芯片技术与传统的仪器检测方法相比具有高通量、微型化、自动化、成本低、防污染等特点。

生物芯片根据芯片上固化的生物材料，分为基因芯片、蛋白质芯片（protein chip）、细胞芯片和组织芯片；根据芯片的制作技术，分为微矩阵和原位合成芯片。基因芯片（genechip）也被称为DNA芯片（DNA chip）、DNA微阵列（DNA microarray）、寡核苷酸阵列（oligonucleotide array），是生物芯片研究中，最先实现商品化的产品。其原理是指采用固相原位合成（in situ synthesis）或显微打印技术，将数以万计的DNA固化于支持物表面上，产生二维DNA阵列然后与标记的样品探针进行杂交，通过检测杂交信号对生物样品快速、灵敏、高效地检测。基因芯片根据载体上DNA种类，分为寡核苷酸芯片和cDNA芯片；根据其用途分为表达谱芯片、诊断芯片、指纹图谱芯片、测序芯片、毒理芯片等。

二、基因芯片的工作原理

在芯片的基片上利用微点阵技术产生不同的DNA阵列，该DNA是人工合成或筛选出的已知顺序的碱基序列。在基因芯片工作过程中，在固定位点使用不同分子生物学技术和碱基互补配对原则与待测基因片段杂交并通过自动阅读设备分析杂交结果，达到定性、定量分析。如果应用适当的技术还能进行结构分析，如对不同的碱基标记不同的荧光于PCR体系，扩增产物与芯片杂交，可直接读出碱基序列。并且同一基因芯片可以同时集成不同的分子生物学技术如PCR、酶切等，以达到同一块芯片能同时检测分析多种基因的目的。

三、基因芯片技术的基本过程

基因芯片技术主要包括4个主要步骤，芯片制备、样品制备、杂交反应、信号检测和结果分析。其发展的最终目标是将整个检测、分析过程集成化以获得微型全分析系统，因而被称为芯片实验室（laboratory on a chip），这样，就可以在一个封闭的系统内以很短的时间完成从原始样品到获取所需分析结果的全套操作。

（一）芯片的制备

选择玻璃片、硅片、瓷片或聚丙烯膜、尼龙膜等为载体，做相应处理后，通常采用下列3种方法制备DNA芯片，①原位合成法（in situ synthesis），如Affymetrix公司开发的光引导原位合成法直接在芯片上用四种核苷酸合成所需的寡核苷酸。②合成点样法，通过液相化学合成寡核苷酸，或通过F′CR扩增基因序列，纯化、定量后，由电脑控制的机器人点样仪准确、快速地将其定量点样于尼龙膜、玻璃片等载体的相应位置上，固定后获得DNA微阵列。该方法根据是否与芯片的表面接触又分为化学喷射法和接触式点涂法。③压电法，通过使用4支分别装有A、T、G、C核苷的压电喷头在芯片上作原位合成，在玻片、硅片等载体原位表面合成寡核苷酸。

玻片处理的方法是包被一层多聚L赖氨酸或一层硅烷，使载玻片带正电荷，以便与带负电荷的DNA结合，在互联网上有斯坦福大学Brown实验室制作玻片微阵列的完整操作流程。

目前商业化的点样针有多种类型，各有其优缺点。基因有限公司推出一种 Micro—CASTerTM手动型微阵列制作系统，可用于低通量的微阵列操作，而不必采用昂贵的芯片点样系统或机器人。它采用8针的点样方式，可在20mm×51mm的膜上点入768个样品点，点样系统内配有表面活性剂，清洗点样针，绝无污染。点完一张片基只需5～20min。

（二）样品的制备

根据样品来源、基因含量及检测方法和分析目的不同，采用的基因分离、扩增及标记方法也各异。样品一般不能直接与芯片反应，须从样品中提取DNA或mRNA，mRNA反转录成cDNA，经PCR扩增、标记，以提高检测的灵敏度。标记方法有荧光标记法、生物素标记法、同位素标记法等。以尼龙膜为载体可用酶一底物显色或同位素32p、33p做放射性标记，通过传统的磷光成像系统如phosphor screen扫描检测杂交信号；不使用荧光标记，因其在尼龙膜上自发弥散，本底过高。

（三）杂交反应

带标记的样品探针与芯片上的靶序列根据碱基互补原则进行分子杂交反应。需根据探针的类型和长度以及芯片的用途选择、优化杂交条件（杂交液、杂交条件和洗涤条件的选择），减少生物分子之间的错配率。杂交反应还必须考虑反应液中的盐浓度、探针序列的G＋C含量、探针所带电荷情况、探针与芯片片基间连接臂的长度及种类，靶序列二级结构等因素。芯片若用于基因表达检测，为了提高检测的特异性、增加低拷贝基因检测的灵敏度，需要较长的杂交时间、高的严谨性、高的样品浓度、较低的杂交温度等；若用于突变检测，要鉴别出单碱基错配，杂交条件则相反，需要更高的杂交严谨性和更短的时间。Nangon公司采用控制电场的方式，使分子杂交时间减至1min，甚至几秒钟。德国癌症研究院的Jorg等认为以肽核酸（PNA）为探针效果更好。

（四）信号检测和结果分析

常用的放射法、荧光法、质谱法、化学发光法、光导纤维法等检测技术都可以用于基因芯片的检测，其中以荧光标记法最为常用，而后3种方法更灵敏、快速，有可能取代荧光法。

用荧光标记的芯片杂交后需用专门的荧光扫描仪检测。杂交反应后的芯片上各个反应点的荧光位置、荧光强弱经过芯片扫描仪（如激光共聚焦显微镜或落射荧光显微镜）检测，严格配对的杂交分子，其热力学稳定性较高，荧光强；不完全杂交的双键分子热力学稳定性低，荧光信号弱（不到前者的1／35～1／5）；不杂交的无荧光，由计算机软件处理分析图像，将荧光转换成数据，即可获得有关的生物信息。检测仪器的分辨率是基因芯片的重要瓶颈。目前专用于荧光扫描的扫描仪大致分为两类：一类是基于CCD（charge－coupleddevices，电荷偶合装置）的方法检测光子；另一类则是基于PMT（photomultiplier tube，光电倍增管）的检测系统。两种设备各有优缺点：CCD一次可成像很大面积的区域，而以PMT为基础的荧光扫描仪则是以单束固定波长的激光来扫描，因此，需要激光头或者目的芯片的机械运动来使激光扫到整个面积，这样就需要耗费较多的时间来扫描，但目前性能最优越的CCD数字相机的成像面积只有16mm×12mm（像素为10μm），因此要达到整个芯片的面积20mm×60mm的话，需要数个数码相机同时工作，或者也可以以降低分辨率为代价来获得扫描精度不是很高的图像。目前生产的商业化扫描仪其性能不同。扫描后的图像还需要分析软件进一步的处理，如Biodiscov－ery的lmaGene系列、Axon Instru－ments的GenePix系列、GSI的QuantArray等。

四、基因芯片技术在分枝杆菌鉴定和耐药性检测中的应用

目前，基因芯片技术主要用于基因表达谱分析、新基因发现、基因突变及多态性分析、基因组文库作图、疾病诊断和预测、药物筛选、基因测序等，此外基因芯片在农业、食品监督、环境保护、司法鉴定等方面都将有广泛的用途。目前许多分枝杆菌16SrRNA和rpoB基因的核苷酸序列已搞清楚，它是高度保守的，只在某些位置上有少数核苷酸变化，而这些核苷酸变化的位置是分枝杆菌属或种特异的。因此，可通过基因芯片技术进行杂交测序，鉴定分枝杆菌菌种。此外，目前的研究已阐明了部分MTB耐药的分子机制，认为MTB耐RFP是由于其作用rpoB变所致；耐INH与katG或inhA操纵子或ahpC操纵子或kas A改变有关；耐PZA是由于其pncA突变所致；耐EB与embABC操纵子突变有关；耐SM是由于其rpsL和rrs突变所致；耐喹诺酮类药物主要是其gyrA或gyrB突变所致。

因此，应用基因芯片分析这些耐药基因突变位点，也可检测耐药的MTB。1998年，Gingeras等首次应用高密度寡核苷酸阵列同时鉴定分枝杆菌菌种和MTB耐RFP基因rpoB突变，使分子菌种鉴定和分子药敏试验方法有机结合起来，两个检测项目同时进行，大大减少了实验步骤，缩短了检测时间，节省了费用。他们测序分析了10种分枝杆菌83株分离株的rpoB和16SrRNA基因序列，以MTB为对照，发现不同分枝杆菌菌种在rpoB 705bp基因序列中存在平均80个多态性部位，而16SrRNA 180bp基因序列内可见21个多态性部位，其中有几个多态性部位是分枝杆菌菌种特异的。在rpoB 705bp片段内，分枝杆菌菌种间的变异从14．3%（龟分枝杆菌和蟾蜍分枝杆菌）到4．1%（鸟分枝杆菌和瘰疬分枝杆菌）；耻垢分枝杆菌（4．2%）、戈登分枝杆菌（3．7%）和偶然分枝杆菌种内差异最大，MTB和堪萨斯分枝杆菌种内差异最小，但在70多株蟾蜍分枝杆菌中未发现核苷酸变异。这两个基因在不同分枝杆菌菌种内的数目也不尽相同，在堪萨斯分枝杆菌和胞内分枝杆菌分离株中只有1／5～1／3的菌株显示有等位基因，而耻垢分枝杆菌和偶然分枝杆菌分离株都显示有等位基因；蟾蜍分枝杆菌rpoB和16SrRNA基因的等位基因数目分别为1个和3个，而胞内分枝杆菌却为4个和1个，MTB和偶然分枝杆菌的等位基因数目相同。因此，应用这2个基因芯片进行分枝杆菌菌种鉴定时，结果不完全一样，如MTB、堪萨斯分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌和龟分枝杆菌分离株rpoB和16S等位基因的差异相似，都相对较小，应用这两个基因芯片对其分离株进行菌种鉴定时可获得相似的结果；鸟分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌和耻垢分枝杆菌分离株的rpoB和16S等位基因虽然差异较大，但这两个基因芯片也能获得相似的有代表性的图谱；应用rpoB基因芯片分析蟾分枝杆菌分离株所观察到的等位基因差异很少，而应用10S基因芯片分析其13株分离株差异就较大；而应用这两个基因芯片分析胞内分枝杆菌和戈登分枝杆菌分离株时，结果正好与蟾分枝杆菌相反。他们应用这两个基因芯片分别分析81株分枝杆菌分离株，其中76株两者的鉴定结果相同；5株结果不同的分离株中，3株用rpoB基因芯片鉴定的结果与传统生化鉴定一样。由此可见，对于那些具有大量16S或rpoB等位基因的分枝杆菌菌种，需通过其他基因组片段来鉴定。此外，他们还应用基因芯片分析MTB分离株rpoB基因序列中705bp片段，确定其突变的部位、性质和发生率。在44株耐RFP分离株中，41株rpoB基因的8个密码子发生12种性质的突变，40株为错义突变，其中531位、526位和513位密码子的突变率分别为35%、28%和25%，1株为6个碱基缺失，只有3株传统药敏试验显示耐RFP的分离株在分析部位未发现突变。

1999年，Troesch等也进行了类似的研究。他们应用16SrRNA基因芯片（分析200bp片段）检测经传统方法鉴定的27种不同分枝杆菌的70株分离株，结果下列菌种的所有分离株均被正确鉴定：亚洲分枝杆菌、龟分枝杆菌、隐藏分枝杆菌、eonspicuum分枝杆菌、库氏分枝杆菌、偶然分枝杆菌、微黄分枝杆菌、戈登分枝杆菌、nterjectum分枝杆菌、中间分枝杆菌、马尔摩分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、shimodei分枝杆菌、猿分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、泥炭藓分枝杆菌、MTB和蟾蜍分枝杆菌，鸟分枝杆菌复合群分离株虽均被鉴定属于该复合群，但4株鸟分枝杆菌分离株中，1株基因芯片鉴定为胞内分枝杆菌；4株胞内分枝杆菌分离株中，也有1株基因芯片鉴定为鸟分枝杆菌或副结核分枝杆菌。由于鸟分枝杆菌和副结核分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌和胃分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌和溃疡分枝杆菌、牛结核分枝杆菌和MTB、龟分枝杆菌和脓肿分枝杆菌在基因芯片上的16SrRNA序列相同，因此，相互之间无法鉴定。此外，他们也应用rpoB基因芯片（分析200bp片段）分析1株MTB敏感株和15株耐RFP分离株，13株耐RFP分离株为点突变，2株分别为3个或6个碱基缺失。

1999年，Head等采用中等密度寡核苷酸阵列上的引物延伸反应进行固相序列分析，比DNA微阵列更简便、价廉，9株耐RFP的MTB分离株均被正确地检测出rpoB 531位或526位密码子点突变。2001年，Mikhailovich等将42条寡核苷酸固定在聚丙烯酰胺凝胶上制备的DNA芯片，可在24h内检测30种rpoB基因突变；采用等位基因特异的芯片上PCR可在1．5h内检测临床标本中的rpoB基因突变；而采用芯片上连接检测反应（on－chip ligase detection reaction）可在一混合物中检测出1%的耐RFP菌株。

上述的研究证明应用基因芯片技术进行分棱杆菌菌种和MTB耐药基因分析是完全可行的，仅需要4h。但目前的研究只是初步的，研究的例数较少，不同研究者应用基因芯片对某些分枝杆菌菌种的鉴定结果尚有矛盾（如应用16S基因芯片分析蟾蜍分枝杆菌分离株），而且只限于检测临床分离株，尚未直接检测临床标本；在耐药基因检测方面，只分析了MTB耐RFP基因型，其他几种主要的抗结核药物均未研究；基因芯片技术尚需进一步完善，目前尚无分枝杆菌商业化检测芯片问世。因此，需继续研究，以期通过基因芯片技术将这两方面的检测结合起来，进行临床分离株和临床标本的分枝杆菌菌种鉴定和MTB耐RFP、INH、PZA、EMB、SM和喹诺酮类药物等基因突变检测，选择和优化基因芯片上的寡核苷酸序列，建立一种新的、快速、敏感、高效的分子菌种鉴定和分子药敏试验方法和标准化的检测芯片，推广应用，以指导临床治疗。

1998年，H37Rv全基因组测序已完成，在微阵列上对其全基因组的变化进行分析成为可能，如BCG是用来预防肺结核的牛结核分枝杆菌的减毒活疫苗，为了更好地了解MTB、牛结核分枝杆菌和各种BCG菌株的不同，Behr等在一个DNA芯片上进行比较杂交试验，H37Rv基因组中的11个区域（包括91个开放阅读架）在BCG菌株中缺失；牛结核分枝杆菌基因组中的5个区域（包括38个开放阅读架）在BCG菌株中也缺失，这对于疫苗的设计与改进将很有益处。由此可见，基因芯片技术可能成为了解MTB分子生物学的有用工具，可建立高密度寡核苷酸阵列分析一些生物学、临床或流行病学上有重要意义的其他基因组序列，如分析MTB特异的基因序列，快速、特异地诊断结核病；分析一些分枝杆菌分子流行病学调查的基因标志物，如Raychaudhuri等应用DNA微阵列分析MTB分离株插入序列IS6110的位置，进行菌株分型，可追踪流行或星状播散的传染源；分析一些与分枝杆菌毒力有关的毒力基因，研究致病性分枝杆菌的发病机制等。Michael Wilson等用含有MTB基因组97%预测出的开放阅读框架的基因芯片，研究MTB在INH作用前后基因表达的变化，结果发现INH诱导了几个在生理学上与药物作用模式有关的编码基因，如MTB5个脂肪酸合成酶Ⅱ编码基因和编码海藻糖转移酶的fbpC基因操纵子；其他没有明显影响生物合成途径的基因如ef－pA、fadE23、fadE24和ahpC基因也被诱导，它们可能与药物毒性的调节过程有关。该研究可能指导新药物作用的靶目标研究及合成抑制这些靶目标的试剂和药物提供新的方法。

简易生物芯片——分子线性探针技术

近年来，随着MTB耐药分子机制逐步得到确认，建立了多种检测MTB基因型、基因序列而推测菌群类别或耐药表型的快速分子技术，获得的信息量介于芯片与普通杂交技术之间，与芯片比较菌群鉴定、耐药检测更快速、更简便。

如用于耐药基因突变检测GenoType?MTBDRplus Assay试剂盒，运用核酸反向线性探针杂交技术检测与利福平耐药密切相关的rpoB基因上一段长约81bp的核心区域——耐利福平决定区（RRDR）以及异烟肼耐药相关的katG基因第315位密码子和inhA基因启动子区的8、15位氨基酸上的常见突变，可在6h内完成耐多药结核分枝杆菌（MDR－TB）检测。在欧美等发达国家，该试剂盒在临床或科研中应用已得到广泛的评价，目前已通过FDA批准可直接用于临床抗酸染色涂片阳性的患者肺部物质或阳性的纯培养细菌。2008年，世界卫生组织亦出台政策推荐使用分子线性探针技术。

耐药性结核杆菌的基因型检测方法还需要注意一些问题。GTplus试剂盒的检测灵敏度有待进一步提高，对于含菌量较少的涂阴标本以及胸腔积液腹水、脑脊液等肺外标本多达不到检测灵敏限。环境及标本中常含有其他分枝杆菌的存在，它们的一些耐药基因与MTB具有一定的同源性。目前对MTB的耐药机制尚未完全明了，基因型检测方法不能检出所有的耐药菌株。因此，“金标准”仍为传统基于培养的表型药物试验，基因型检测法仅作为一种辅助方法。

五、存在问题及发展前景

目前，国内外已经有许多从事DNA芯片研究的公司，每家公司的芯片技术都各具特色，应用目的也不尽相同。但要成为实验室研究或临床可以普遍采用的技术仍有一些关键问题亟待解决，如基因芯片特异性有待提高，样品制备和标记操作麻烦、信号检测灵敏度不高和有待研制高度集成化样品制备、基因扩增、核酸标记及检测仪器。在芯片的功能集成方面，目前Nanogen公司、Affymetrix公司、宾夕法尼亚大学医学院和密歇根大学的研究人员通过利用在芯片上制作出的加热器、阀门、泵、微量分析器、电化学检测器或光电子学检测器等，将样品制备、化学反应和检测3部分做了部分集成。1998年6月，Nanogen公司首次报道了用芯片实验室所实现的从样品制备到反应结果显示的全部分析过程。这个实验室的成功是生物芯片研究领域的一大突破，它向人们展示了用生物芯片制作芯片实验室的可能。上述问题不仅是当前和今后一段时期内国内外基因芯片技术研究的焦点，同时也是基因芯片能否从实验室研究推向临床应用的关键问题。此外，生物芯片技术商业化进程很缓慢的原因，还在于目前的条件下芯片的生产时间长、成本昂贵，难以投入规模生产。

尽管基因芯片发展时间不长，迄今在医学研究实际应用中的例子还不多，还存在这样或那样的问题，但它在诸多领域已呈现出广阔的应用前景。目前基因芯片还处在研究阶段，但随着研究的不断深入和技术的更加完善，一定会在生命科学研究领域发挥出其非凡的作用，必将对21世纪人类生活和健康产生极其深远的影响。

（綦迎成　丁元生）

参考文献

［1］闫国蕊，苏保亮．结核病细菌学检验技术．郑州：郑州大学出版社，2001：107－119

［2］董安国．现代耐药结核病学．北京：中国科学技术出版社，2005：84－173

［3］吴雪琼．分枝杆菌分子生物学．北京：人民军医出版社，2010

［4］熊礼宽．结核病实验诊断学．北京：人民卫生出版社，2006：227－300

［5］何家荣．实用结核病学．北京：科学技术文献出版社，2000：41－47

［6］张敦熔．现代结核病学．北京：人民军医出版社，2000：62－212

［7］彭卫生．新编结核病学．北京：中国医药科技出版社，2003：570－578

［8］张敦熔．结核病新概念．北京：中国农业科技出版社，1995：5－15

［9］朱水方．实时荧光聚合酶联反应PCR检测技术．北京：中国计量出版社，2003：1－50