利用基因芯片鉴定细菌

利用基因芯片鉴定细菌_基金工程与分子生

实验二十二　利用基因芯片鉴定细菌

一、实验目的

学习利用基因芯片技术鉴定大肠杆菌(Escherichia coli)和油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris，X．campestris)。掌握DNA荧光标记、杂交反应和芯片检测技术的原理和方法。

二、实验原理

通过化学修饰可使玻璃片表面富含氨基。基片上的氨基所带的正电荷与核酸磷酸骨架所带的负电荷在中性溶液中能够相互作用，使核酸吸附在基片表面，用紫外线(UV)照射或加热处理后，DNA上胸腺嘧啶碱基上的氨基与基片上的氨基之间形成共价键。这样核酸作为探针就能够固定在玻璃基片的表面构成基因芯片。

样品的基因组DNA经过PCR扩增和荧光标记后，与芯片上的核酸按照碱基配对原则进行杂交，如果完全配对就能形成稳定的双链，利用特定的光学仪器，可以检测到这些带有荧光标记的双链核酸，从而对待检样品进行检测和分析。基本原理如图22-1所示。

本实验所用的芯片(见图22-2)上有4个点阵，每个点阵设计(6行6列)完全相同，都有三行阳性对照(标记有荧光染料HEX的核酸)，一行阴性对照(50％DMSO)，一行大肠杆菌探针和一行黄单胞菌探针。大肠杆菌探针是E．coli K12菌株的chaperone Hsp70基因，单胞菌探针是Xanthomonas_campestris_8004菌株的HtpG基因(两个基因没有同源性)，分别设计这两个基因的特异性引物。每一个基因都设计两对引物，其中一对引物不用荧光染料HEX标记，另一对引物用荧光染料HEX标记5'末端。这样一共得到4对引物。首先使用未标记荧光染料的引物，以细菌基因组DNA为模板，PCR扩增出DNA片断，作为探针固定在玻璃基片上。然后使用标记荧光染料HEX的引物，以另外的待测样品为模板，PCR扩增出DNA片断，与芯片上的探针杂交，利用CCD扫描仪扫描，就能检测出待测样品中是否含有这些基因。

图22-1　氨基基片制备微生物芯片的检测原理示意图

如图22-2所示。

扩增E．coliK12菌株chaperone Hsp70基因的引物:

正向引物:186→205:(5')GCAAAACACTCTGTTTGCGA(3') Tm=60.0

反向引物:581→561:(5')TCATAAACCGCGATAGTACGG(3') Tm=60.0

PCR扩增长度:396bp

扩增Xanthomonas_campestris_8004菌株HtpG基因的引物:

正向引物:(5')549→568:GAAGGAAGGCGAAGAGTCCT(3')Tm=60.0

反向引物:(5')983→964:TTGATGAAGCGCAGGTACAG(3') Tm=60.0

PCR扩增长度:435bp

图22-2　芯片设计与杂交反应检测结果示意图

三、实验仪器、材料和试剂

1.仪器:水浴锅，微量移液枪，枪头，离心机，50mL锥形离心管，水平摇床，镊子，杂交围栏及配套模具，芯片盖片，杂交盒，金属夹(2个)，清洗盒(2个)和芯片扫描仪等。

2.材料:含有大肠杆菌和黄单胞菌荧光标记的基因芯片。

3.试剂:大肠杆菌和黄单胞的菌荧光标记样品(北京博奥生物有限公司生产)，100％甲酰胺，10％SDS，20×SSC，洗液Ⅰ(2×SSC，0.2％SDS)，洗液Ⅱ(0.2×SSC)，蒸馏水。

四、实验步骤

(一)芯片的预处理(以下操作请戴上手套)

1.小心撕开杂交围栏上的不干胶和贴纸，如图22-3所示。

图22-3　撕开杂交围栏上的不干胶和贴纸

2.用镊子夹住围栏放入与之相配套的模具凹槽中，使杂交围栏与凹槽契合，注意有粘性的一面朝上，如图22-4所示。

3.用手拿着芯片上贴有标签纸的一端，手腕旋转180°，将贴有标签纸的一面向下，然后让芯片无标签纸的另一端倾斜地放入模具的顶端，再将芯片贴有标签纸的一端轻轻放下，使芯片上的4个点阵被杂交围栏分隔成4个样品室，以免杂交液相互污染，如图22-5所示。

图22-4　将杂交围栏胶面朝上放在杂交模具中

图22-5　将芯片放在杂交模具中

4.用镊子轻轻按压芯片与杂交围栏的结合部位，使杂交围栏紧贴在芯片上。如图22-6所示。完成后，注意芯片不要长时间暴露于空气中，以免芯片背景太脏产生假阳性实验结果。

图22-6　用镊子轻轻向下按，使杂交围栏贴在芯片上

5.打开杂交盒，将蒸馏水(约200μL)注入杂交盒底部，防止杂交过程中杂交液的大量挥发，如图22-7所示。

6.把芯片放入杂交盒中，注意贴有标签纸和围栏的一面朝上。

7.盖上与芯片相配套的盖片，注意使盖片上的凸面朝下，使盖片上的4个突起正好覆盖4个点阵，形成4个微量的杂交室，如图22-8所示。

8.盖上杂交盒的盖板。

(二)芯片杂交

1.每张芯片有4个样品室，每个样品室中加入12μL的杂交液。取4只0.2mL的离心管，按表22-1方法配制杂交液(12μL)。

图22-7　往杂交盒底部的凹槽中均匀加入少量蒸馏水

图22-8　把芯片放入杂交盒

表22-1　　　　　12μL体系杂交液的配方

注意:在配制的4份杂交液中，表中“水或荧光标记物”一栏分别加入4μL大肠杆菌的荧光标记物(被测样品1)，4μL黄单胞菌的荧光标记物(被测样品2)，2μL大肠杆菌和2μL黄单胞菌的荧光标记物的混合液(被测样品3)，4μL超纯水(作为阴性对照)。

2.将以上4份12μL杂交液混匀后，掌上离心机瞬时离心。PCR仪中95℃热变形3min后，冰浴骤冷1min。打开杂交盒的盒盖，用移液枪将每份杂交液从盖片的小孔中分别注入4个样品室中(不同杂交液加样时注意换新枪头)，记下每个样品室所加入的相应的杂交液种类。如图22-9所示。

3.确认杂交液覆盖芯片上的4个点阵以后，盖紧杂交盒盖。确保槽板两端的定位销分别插入盖板两端的定位销空中。扣上盖板，分别将两个金属夹卡进两侧，动作要平缓，不要让杂交盒有大的震动，以防止杂交液溅出点阵区域外;另外，金属夹需要完全卡进，以确保杂交盒的密封性。不要震动盖玻片或芯片以免破坏各杂交腔室内形成的液膜。将杂交盒放入42℃水浴中，杂交2h，使样品与探针充分反应，如图22-10所示。

(三)芯片清洗

1.将洗液Ⅰ，洗液Ⅱ预热至42℃。

图22-9　用移液器将四份杂交液分别注入盖片上的四个小孔

注:由于每张芯片上的4个样品点阵是完全相同，如图22-2所示，都是6行6列，每一个点阵中的每一行探针种类相同，其中第1、3、6行探针都为阳性对照(即标记有荧光染料HEX的核酸)，第5行为阴性对照(50％DMSO)，第2行为大肠杆菌探针，第4行为黄单胞菌探针，因此每个杂交室中的杂交液种类可以随意加入，但一定要记录下每个样品室所加入的种类。由于一个杂交室空间有限，因而从盖片小孔中加入杂交液后，杂交液会在杂交室内扩散形成液膜，覆盖整个杂交室，因而每个室内整个点阵都会有相应的杂交液样品覆盖进行杂交反应。应注意加杂交液时最好一次加入，以免杂交室内有气泡而影响实验结果。

洗液Ⅰ成分　　　　　2×SSC，0.2％SDS

洗液Ⅱ成分　　　　　0.2×SSC

2.杂交结束后，从杂交盒中取出芯片，将芯片正面朝上放入盛放洗液Ⅰ的清洗盒中。将清洗盒放在水平摇床上，水平摇床80rpm晃动，清洗4min，以洗去没有与探针特异性结合的样品。

图22-10　盖紧杂交盒盖

3.在洗液Ⅰ中清洗结束后，用镊子将芯片转移到盛放洗液Ⅱ的清洗盒中，正面朝上，水平摇床80rpm晃动，清洗4min。

4.清洗完成后，将芯片放入50mL锥形离心管中(有标签纸的一端朝下)，1500rpm离心1min，除去玻片表面的液体，下一步进行芯片扫描。

(四)检测步骤与结果(以北京博奥生物有限公司生产的晶芯Ecoscan100芯片扫描仪机器为例)

1.启动生物芯片扫描仪系统，系统会进行开机自检，如图22-11所示。

图22-11　系统开机自检

4.选择扫描区域，进行扫描。

在对芯片执行扫描前，应判断芯片扫描方案与要扫描的芯片区域是否一致。

方法一:单击“选择扫描区域方案”按钮:系统显示出已有的芯片扫描区域方案，选择与当前要扫描的芯片区域相一致的芯片扫描方案(图22-12)。

图22-12　扫描区域选择

方法二:单击“扫描区域管理”按钮:系统显示出扫描区域管理界面如图22-13所示，用户在其中选择与当前要扫描的芯片区域相一致的芯片扫描方案。

单击“设定”按钮，将该芯片区域扫描方案设为当前的芯片区域扫描方案。

图22-13　设定当前扫描区域的界面

设定芯片扫描区后，在系统参数显示区的当前扫描参数中看到当前的芯片扫描方案相关信息(图22-14)。

图22-14　扫描方案信息栏

图22-15　扫描等待

6.图像扫描后，经过处理的图形显示在“图像显示区”中。如图22-16所示。

图22-16　图像扫描结果显示

7.扫描后的图像将自动进行分析，结果分别显示在“图像数据显示区”和“实验描述区”。图像分析后，经过处理的图像数据显示在“图像数据显示区”中。图22-17为黄单胞菌的检测结果，可以看到曲线勾勒出的是芯片上黄单胞菌的检测行，结果分析栏中黄单胞菌框中显示“阳性”。

图22-17　黄单胞菌(XCC)的检测结果

同理，图22-18是E．coli的检测结果。

8.图像扫描后，单击“图像显示区”右侧的“”，将扫描结果图保存到数据库中，选择要保存的路径名和文件名，如图22-19所示，将图像保存为位图(BMP)格式的图像文件。

9.改变扫描区域，重新扫描，显示扫描结果并存储(操作同上)。

11.关闭激光器，退出检测系统，关闭扫描仪电源。

图22-18　大肠杆菌(E．coli)的检测结果

图22-19　选择保存路径和文件名

(五)微生物芯片检测参考结果

根据添加的微生物PCR扩增产物的不同，会有不同的检测结果，通常有以下4种情况出现，供实验分析中参考。

1.PCR扩增产物中含有大肠杆菌的基因片段，检测结果如图22-20(a)所示。

2.PCR扩增产物中含有黄单胞菌的基因片段，检测结果如图22-20(b)所示。

3.PCR扩增产物中同时含有大肠杆菌和黄单胞菌的基因片段，检测结果如图22-20(c)所示。

4.PCR扩增产物中没有含大肠杆菌和黄单胞菌的基因片段，检测结果如图22-20(d)所示。

图22-20　微生物芯片检测的参考结果

(六)芯片检测过程中的注意事项

1.生物芯片在装入扫描仪的过程中，注意将芯片贴黑色围栏的一面(或贴标签的一面)朝仪器面板指示灯的方向，手握贴标签的这一端，然后轻轻用力插入芯片卡盒中。

2.在芯片扫描过程中最初扫描应该在参数设置菜单中观察一下芯片上信号点是否清晰，如果不清晰应该先利用当前菜单功能进行调焦操作，保证信号点最清晰、最亮为止，这样才能获得满意的扫描检测结果。

3.在扫描结束后首先获得的是一幅原始图像，通过这种原始图像可以了解芯片的扫描位置是否正确，芯片的背景是否干净，芯片信号强度是否合适等综合情况。对于图像质量出现问题的几种处理办法如下:

(1)如果扫描位置不正确，可以利用区域管理菜单调整扫描区域的坐标(左上角坐标和右下角坐标)。

(2)如果扫描芯片的背景不干净，可以利用区域管理菜单调整扫描区域的坐标(左上角坐标和右下角坐标)，缩小扫描区域范围，躲开有大噪声点的区域，尽量减少这些噪声点对分析结果的影响。

(3)如果扫描芯片信号强度过于饱和，可以利用参数设置菜单降低激光器的照射强度，反之，如果扫描芯片信号强度比较暗，可以利用参数设置菜单提高激光器的照射强度。

4.对于芯片质量比较差的芯片，扫描结束后系统会自动提示芯片质量异常，从扫描获得的原始图像中可以看出噪声很多、很大，或是信号点非常弱，这说明当前的芯片是没有用的(应该重做杂交实验)，同时，就应该退出该芯片不再用它来扫描或进行分析等。然后，换上下一张芯片，再进行扫描与分析。

5.如因扫描位置偏离出现扫描结束后系统提示的芯片质量异常，可以利用区域管理菜单调整扫描区域的坐标(左上角坐标和右下角坐标)来解决这种问题。

五、思考题

1.生物芯片鉴定实验与Southern Blotting鉴定目的DNA片段实验有何异同?

2.你认为该实验产生阳性结果的原因有哪些?