拮抗细菌拮抗作用的物质基础

拮抗微生物在代谢活动中通过分泌抗菌物质直接对病原物产生抑制是自然界中普遍存在的现象,也是众多拮抗微生物应用的物质基础。作为微生物代谢产物的抗生素,对于抑制病原菌的侵染和病害的发展有着重要作用。传统的方法是用对峙培养法测定抑菌圈,以确定该菌在生物防治中有无抗生素的涉及,但这种方法并不能直接证实在实际的生态环境中抗生素依然产生并起到抑制病原的作用。最近,液相色谱分析证实了荧光假单胞菌在土壤中仍然可以产生抗生素。进一步运用遗传工程技术使荧光假单胞菌丧失抗生素的产生能力并伴之失去防病能力,经修复还原抗生素代谢能力后,生物防治活性也恢复到野生菌株的水平,从而证明了抗生素在生防中的重要作用[29]。

拮抗微生物产生的抗菌物质主要有两类:一类是小分子的抗生素;另一类是大分子的抗菌蛋白或细胞壁降解酶类。

(1)抗生素类

芽孢杆菌抗生素是其表现抗菌作用的重要物质基础之一。芽孢杆菌的抗生素有核糖体和非核糖体合成2类。非核糖体合成的抗生素包括脂肽抗生素(lipopeptide)、多肽抗生素和次生代谢产生的抗菌活性物质。

①脂肽抗生素

Iturin家族脂肽抗生素,一般对真菌具有强烈拮抗作用。目前报道的有B.subtilis合成的Iturin A,C,以及BacillomycinL,D,F和Mycosubtilin等[15,30,31]。

②多肽抗生素

芽孢杆菌多肽抗生素有线状、环状和分支环状3类。Gramicidin和Edeine 是B.brevis产生的线状抗真菌短肽[13]。Gramicidin S和Tyrocidine是B.brevis产生的环状短肽抗生素[30-32]。分支的环肽抗生素包括Polymyxin,Octapeptins,以及Bacitracin。它们主要作用于细菌。近年来多肽类抗生素的研究日益受到重视。研究的进一步发展可通过基因定点突变技术对其分子结构进行修饰,以提高其活性。如Chen等(Chen H C,Brown J H,Morell JL,1998)采用该技术修饰抗菌肽Magainin 2,使其活性提高了100倍,与其他抗生素化学或半合成修饰相比,既方便,又省成本[33]。

③其他抗生素

Zwittermicin A是线状聚酰胺物,在B.cereus和B.thuringiensis的很多菌株中都存在[31]。Zwittermicin A对原核生物和真菌具有广谱抑菌活性,对Phytophthora和Pythium属病原真菌活性极强,并对Bt杀虫晶体蛋白具有协同增效作用。

(2)核糖体合成的抗菌蛋白

芽孢杆菌分泌产生的蛋白类抗菌物质主要有细菌素、细胞壁降解酶(如几丁质酶和葡聚糖酶)以及一些未鉴定的抗菌蛋白。

①细菌素

细菌素是细菌合成的对其他微生物具有抗生作用的小分子量蛋白质。芽孢杆菌能产生多种细菌素[32,35]。枯草芽孢杆菌产生的Subtilis和Subtilisin及巨大芽孢杆菌产生的Megacins对G+细菌具有很强的活性。枯草芽孢杆菌产生的Botrycidin AJ1316,Alirin B-1,6.9 k Da小肽,以及Bacillus licheniformis M-4产生的M-4 Amoebicidal同时具有抗细菌和真菌作用。

②几丁质酶和葡聚糖酶

许多病原真菌细胞壁含有几丁质和β-l,3-葡聚糖。几丁质酶(chitinase) 和β-l,3-葡聚糖酶(glucanase)是植物病程相关蛋白。它们通过破坏病原真菌的细胞壁而具有抗菌防病作用。最早报道几丁质酶活性的微生物是芽孢杆菌B.chitinovrous,目前涉及B.subtilis,B.coagulans,B.megaterium, B.licheniformis,B.thuringiensis,B.cereus,B.circulans, B.stearothermophilus,以及B.pabuli等很多芽孢杆菌种群[36-37]。

③其他抗菌蛋白

Tas A(transition-phase sporeassociated antibacterial-protein)抗菌蛋白是Axel从枯草芽孢杆菌PY79菌株分离的孢子成分,对G+和G-细菌具有广谱抗菌活性[35]。基因tas A是通过氨基酸序列测定和枯草芽孢杆菌基因组序列文库比较获得的。Tas A前体为34k D孢子内蛋白,经信号肽酶Sip W加工除去N端27个氨基酸成为31 k D活性蛋白形式,并进一步掺入孢子外衣,但对孢子形成无明显作用。近年来我国有很多分离纯化枯草芽孢杆菌未知抗菌蛋白的报道,如B034菌株50.3 k Da和A014菌株22.5 k Da抗水稻白叶枯病蛋白,以及BS-98菌株59k Da,TG26菌株14k Da,B3菌株13k Da和BS-908抗真菌蛋白质等,但还未见到有关基因研究的报道[16]。

芽孢杆菌类生防细菌大多是通过产生抗菌蛋白或裂解酶抑制病菌的侵染。如抗稻白叶枯病的芽孢杆菌A014,枯草芽孢杆菌B034,A30,XML6,B0113, BS—98,TG26,B—916,B3,青枯生防菌芽孢杆菌B130,芽孢杆菌属的XA 1, XF1等菌株[36]均能产生抗菌蛋白或多肽。B.brevis可分泌抗黄瓜白粉病菌的短杆菌肽(gramicidin)。解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)产生一种抗真菌环状多肽,即Iturin A2。徐敬友等(2002)发现,抗灰霉等多种病原真菌的地衣芽孢杆菌和多粘类芽孢杆菌培养液中具有拮抗活性的物质是一种蛋白或多肽。Wakayama(Wakayama S,Lshikawa F Osihik,1984)从蜡状芽孢杆菌(B.cereus)中纯化出一种抗真菌环状多肽Mycocerin。其抑菌谱广、活力强,能同时对丝状真菌和酵母起作用,且耐热性和稳定性好。裴炎等(1999,2002)的最新报道称,从蜡状芽孢杆菌S-1菌株中分离出抗真菌多肽APS-1环状多肽,浓度为2μg/mL即可抑制黑曲霉和瓜果腐霉,并且已经分离、纯化出该物质。另一经常报道的抗菌细菌为枯草芽孢杆菌(B.subtilis)。如刘颖等(1999)从枯草芽孢杆菌中分离出的抗真菌肽LP-1,为一种广谱抗真菌小肽,对瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)、玉蜀黍赤霉病菌(Gibberella zeae)、长柄链格孢(Alternaria longipes)和水稻稻梨孢(Pyriculoria oryzae)等有很强的抑制作用[40]。孔建等(1999)报道,枯草芽孢杆菌B-903产生一种耐高温抗菌物质,有广泛的抑菌谱,包括土传镰刀菌(Fusarium axysporium)、气传植物病原菌(如苹果轮纹病)(Physalospora piricola)、番茄早疫病(Alternaria solani)和韧皮部病菌[41]。近来,国内外学者还利用体外合成的多肽物质对病原微生物进行拮抗试验,也收到了很好的效果。如Kanniah Rajasekaran等在体外合成的多肽D4E1对子囊菌类、担子菌类、半知菌类、卵菌类以及细菌都有很好的抑制效果(Kanniah Rajasekaran,2001)。Gul Shad Ali and A.S.N.Reday也发现,一种环肽能广泛抑制植物病原真菌和细菌(Gul Ahad Ali and A.S.N.Reddy, 2000)。BelenLopez-Garcia等对引起水果腐烂的植物病原真菌起抑制作用的六肽进行了鉴定和特性分析(BelenLopez-Garcia,2000)。中科院上海生物工程研究中心的陆莹瑾等固相合成了4种抗菌肽,对多种植物和动物病原细菌均具有抗性[42-45]。