分枝杆菌菌株的保藏

作为代表生物多样性物种资源的组成部分，许多国家都已建立了专门的菌种保藏机构。全世界的菌种保藏机构在300个以上，如著名的美国标准菌种收藏所（American Type Culture Collection，ATCC）、英国的国立标准菌种收藏所（National Collection for Type Culture，NCTC），还有全球性的世界微生物保存联盟（World Federation of Culture Collection，WFCC）。这些机构都提供出售和交换菌种服务并出版菌种目录。我国在1979年成立了中国微生物菌种保藏委员会（China Committee of Culture Collection for Microorganisms，CCCCM），制订了组织和管理条例。能按照国家有关规定，与工作内容密切联系相关、生物安全防护设施符合相关要求、实验技术和实验手段较先进的微生物实验室，允许保存部分标准菌株和临床分离菌株。

一、保存菌株的应用价值

随着结核病控制工作的不断深入，无论是从分枝杆菌病的基础研究、临床诊疗，还是制订流行病学控制及预防措施等各方面，均对实验室科学技术研究提出了更高要求。而实验室研究的课题设计、实施，都依赖相关生物材料的丰富和充实。因此，建立相应分枝杆菌的菌株库，既是进一步提高科学研究水平的物质基础，也是相应科研的物质保障。菌株库中保存的菌株，在基础实验室的科研、临床和流行病学工作中能够承担以下几方面的工作。

（一）分枝杆菌标准菌种

目前经分离、鉴定、命名并公布的分枝杆菌已达百余种。此类分枝杆菌的生物性状（如分离方法、孵育条件、生长速度、细胞和菌落形态、微生物鉴定生化反应特征、对常用抗结核药物的耐受性、对感染宿主的致病性等）、遗传基因特征（如16s～23sRNA特征）、分枝菌酸组分情况等，均成为对临床分离的分枝杆菌进行菌种鉴定的参考依据。因此，相应实验室和科研机构保存常见的分枝杆菌标准菌种，是全面系统地了解和开展分枝杆菌微生物学研究的物质基础和参照保证。

（二）了解分枝杆菌生物性状的多样性，建立并完善实验室质量保证工作的参照系统

在实际工作中最常见的是野生及从临床标本中分离的分枝杆菌菌株，其中占绝大多数的是结核分枝杆菌和已知种类的非结核分枝杆菌。此类菌株中，部分菌种的生物性状、遗传基因特征、细菌菌体组分具有一定特殊性或代表性，如对常用抗结核药物有耐受性的菌株、经检测证实发生基因突变的菌株、引起被感染宿主病变的非结核分枝杆菌菌种分离株等。此类菌株一方面充分反映了各种分枝杆菌在自然界及感染后发病宿主中的生存、繁殖状态，也可作为临床检验质量评估工作的参照标本。分枝杆菌菌种分离株的另一重要作用是发现新的分枝杆菌菌种，对工作中分离的个别生物性状、遗传基因特征、菌体组分与公布的已知分枝杆菌菌种存在一定差异的抗酸菌，应加以高度重视并予以妥善保藏已备进行深入、细致的研究。因此，保存各种生物性状的分枝杆菌分离菌株，有助于对相应细菌的生物性状进行全面和深入的了解和研究。

（三）科研工作的重要实验材料和物种资源

目前，随着世界各种组织和各国对结核病及分枝杆菌病的日益关注，相应的科研工作也随之展开。从已报道的科研报告中不难发现，分枝杆菌细菌学和分子生物学基础及应用技术、临床诊疗及流行病预防和控制工作等各方面的科学研究，都依赖于妥善保存的各种分枝杆菌标准菌种和临床分离菌株。另外，由于分子生物学技术的应用，科研工作中生物工程重组菌苗也不断出现，作为科研报道的直接证据，此类菌苗也需要予以妥善保藏。因此，菌株库为科研工作提供了各种研究设计所需的相应材料和物种资源，有力地保证了课题的顺利实施。

二、保存菌株的背景资料

作为一个完整工作体系的一部分，各实验室应按照国家和主管部门的相关规定制订严格的菌株保存和管理措施，并建立保存菌株的质量保证实验体系。由于保存的菌株主要是为临床诊疗及科学研究服务，所以每一个菌株除了一个独立的保存编号以外，相应菌株资料的完整性也至关重要。

根据开展的工作项目，菌株资料主要由以下几方面组成，即菌株分离来源的资料、相应菌株的生物性状及遗传基因特征的鉴定和检测结果记录、冻存菌株质量保证实验记录和复核记录、冻存菌株使用情况记录、从临床患者分离且决定长期冻存的特殊菌株应有较完善的临床和流行病学调查资料。所有已冻存菌株的有关资料应充分核实并予以备份。

（一）菌株的冻存编号

根据各实验室自身的情况，每一个冻存菌株必须编制独立的冻存号码，以便彼此区分。

（二）菌株发现分离来源的资料

包括标本种类、标本性状、孵育前抗酸染色菌体形态（直接涂片镜检是阳性结果的标本）、前处理方法、分离培养基种类、分离培养接种时间、孵育温度、可视菌落出现时间（d）、菌落经抗酸染色后的镜检情况（包括菌体形态、细菌菌体索状聚集情况、菌体易染颗粒情况）、结果报告时间、分离培养的实施者。

（三）菌株生物性状和遗传基因表达特征

根据实验室开展的实验工作内容，尽量检测并记录相应菌株的初代（或次代）生物性状和遗传基因表达特征，以便获得相应菌株的完整资料。

1．生物性状

（1）一般表型：细菌生长所需的营养条件、最适宜的孵育温度（28℃、37℃和42℃生长情况）、最适温度孵育下可视菌落出现时间、菌落形态、色素产生（光、暗产色或不产色）情况。

（2）菌株各项菌种鉴定实验结果：包括进行各项实验的日期、检测者、各项观察性状表现及生化反应实验结果及最终确定的种名。

（3）对常见抗结核药物耐药性检测结果：包括检测药物的种类和浓度、药物敏感性检测方法、检测日期、结果报告日期、检测者。

2．遗传基因表达特征

（1）生物性状的稳定性：在排除检测实验误差的前提下，检测并记录相应菌株经多次传代后，各项生物性状的表现变化情况。

（2）如果菌株冻存单位的实验技术和条件允许，宜检测相应菌株的耐药基因情况、细菌菌体组分情况、16s～23sRNA编码情况予以检测并进行遗传稳定性跟踪。对经过生物工程实验产生的菌苗，必须检测和跟踪相应的基因表达特征。

（四）冻存菌株存活质量保证实验

实验室冻存菌株管理人员应制订有关规程，定期抽检部分已冻存的菌株，完成菌株复活及相应生物性状和遗传基因表达特征检测实验并与此前的相应检测结果进行对比。

（五）冻存菌株的使用情况记录

由于分枝杆菌属于国家规定的二类危险性微生物，各实验室应制订严格的菌株使用管理制度，详细记录菌株使用的时间、菌株编号、菌株交接和实验情况。严禁未经登记从菌株库中提取任何菌株。

（六）从患者分离的特殊菌株应记录的临床和流行病学调查资料

经临床确诊因受到感染而直接造成机体某些部位患病并直接从患病部位分离的非结核分枝杆菌菌株或具有特殊临床或流行病学的意义的分枝杆菌菌株，一旦被菌株库保存，还应保存相应患者的临床和流行病学调查资料。

1．临床资料 包括患者姓名、年龄（出生日期）、性别、病案号，被相应菌株感染后引起患病的部位、诊断并发症、患病情况、治疗药物、有无使用免疫制剂、治疗效果等诊疗内容。

2．流行病学资料 患者相对完整的流行病学资料需要通过严密设计的问卷调查来获得。而对患者来说，由于所调查的内容均需要根据记忆来回答；故一个答案的准确性，需要设计调查问卷时提出多个问题而进行印证。因此，流行病学调查问卷均根据调查者需要了解的情况进行设计，无固定的格式和内容。结核病常用的流行病学调查问卷一般包括以下内容。

（1）患者一般情况调查：发病时所在地点、发病时从事的职业、患者生活状态、患者业余爱好。

（2）患者结核病病史：主要目的是为确定患者是初治还是复治病例，或有无抗结核药物使用史。

（3）患者可能的菌株感染史：此类调查主要目的是为推断患者可能感染相应菌株过程提供相对合理的依据。包括患者出生地点、患者曾经长期居住（≥1年）的地点、患者接受教育的经历和地点、患者从业经历和地点、患者家族（亲属）人群中有无相同疾病患者、患者因认知而交往的人群中（包括所有曾经的同事、朋友）有无相同疾病患者、患者较频繁出入的人群聚集地（市场、公共交通工具、娱乐休闲场所等）、患者曾经的就医地点和各种病症史等。对因皮肤病变而分离出分枝杆菌的患者，还需了解患者近期（1～2年）详尽的皮肤创伤史（甚至包括正常医疗诊治需采取的措施，如肌内注射）。

三、菌种的保存方法

与其他微生物一样，分枝杆菌也具有稳定遗传性和变异性。遗传性是保证微生物本身特征的相对稳定，即无性繁殖过程中能够保持原有的生物性状，遗传性为菌种保藏提供了有利因素和评定保存质量的参考指标；而变异性，是指微生物的性状在繁殖过程中可能出现某些改变，这一特点给菌种保藏带来了一定的困难。由于存在变异，使被保存的菌种出现“衰亡”，主要指繁殖性状的退化，甚至丧失，从而导致发育缓慢，存活率降低、死亡等现象。菌种保藏工作就是使菌种的变异降低至最小水平，使菌种在较长期的保藏之后仍然保持着原有的生物性状和遗传基因特征且不被其他菌株和杂菌污染。能够长期在临床检验、基础和流行病学研究方面得以应用。

微生物的变异速度，在自然条件下，与其新陈代谢速度有关。微生物代谢活力旺盛，则它的变异速度快；代谢活动微弱，变异速度就慢。并且在多次的无性繁殖过程中可能会有突变的积累。人们利用这一规律，可以创造各种条件，使微生物处于微弱活动或不活动状态，以减少变异的发生。

（一）菌种保藏的目的非常明确

在各项研究工作中，同一菌种在工作过程及结束后，均可获得重复的实验结果；通过生物工程技术所得的重组菌苗必须保持其遗传特性表达的稳定性；由于对菌株生物性状的稳定和菌种的纯度要求严格，所以科研工作多数情况下是选择单一菌落，经移种扩菌后实行大量且长期的保藏。而以临床或流行病学为目的的实验，要求通过检查分离的菌株，能够获得有助于确定医疗诊治方案或代表流行病学特点的结果，故一般是将分离菌株的全部生长菌落统一保存。

（二）菌种保藏的原则

既要随时可以使用这些菌种，又要尽可能减少甚至不产生遗传变异。根据这一原则，各种设备和各项管理措施较完善的菌株保藏实验室，一般将相应菌株按照使用频度，划分为常用菌株和长期保藏两部分。对常用菌株，在其各项生物性状保持稳定的前提下，一部分采用移种传代供日常使用，另一部分予以同株的大量保藏；当日常使用的菌株生物性状发生变化，取出保藏菌株进行移种传代，生长后对次代菌株再次大量保存以供日后使用。

（三）菌种保藏的原理

通过低温、干燥、隔绝空气和断绝营养等手段，以达到最大限度地降低菌种的代谢强度，抑制细菌的生长和繁殖。由于菌种的代谢相对静止，生命活动将处休眠状态，从而可以保藏较长时间。

菌株保存方法，根据需要移种传代间隔的时间，能够分为短期（3～24个月）和长期（≥2年）保存方法。

（四）短期保存方法

此类方法适用于实验和防护条件较低的实验室，特别是保存经分离培养获得的野生和临床分枝杆菌菌株。短期保存方法虽然简便，但为保证被保藏分枝杆菌的活性，需要定期移种传代，因此容易造成细菌的变异，不利于物种原始生物性状保持稳定。

1．斜面保藏法

（1）罗氏培养基直接保藏：这是一种最基本的方法，适用范围广，对生长速度快、慢的分枝杆菌都可应用。分离的分枝杆菌移种罗氏培养基（L－J）斜面、在适当孵育温度条件下生长良好后，菌株置于4℃左右保藏。该方法对一般慢生型分枝杆菌可保藏3～6个月；生长速度快的分枝杆菌能够保藏2～3个月。到期后重新移种一次。当然保藏培养基、温度和时间都不是绝对的，个别菌种需要结合菌种所需的营养条件、生长速度、繁殖能力对移种传代的时间间隔进行适当调整。这种方法的弊端是传代次数多了容易发生变异，如导致部分分枝杆菌繁殖能力下降、生物性状发生变化、毒力减小甚至基因失落等；同时传代次数多也容易使污染机会增加。建议实验室采用密封性能较好的螺旋口试管替代传统的胶塞并保存生长菌落发育充分的培养物，有利于保藏菌种的稳定。

注意事项：由于斜面冰箱保藏是在4℃下进行，分枝杆菌分离物活动并未停止，需要经常转管移接，因此对于保藏所用的斜面菌种质量要求较高，其菌落形态、生长速度等生物性状应保持原有特性。操作人员必须对斜面菌种质量具有一定的鉴别能力，所挑选的菌种才能适合保藏；此外，菌种的菌龄不能太幼也不能太老，否则冰箱保藏后移种传代易造成菌株衰亡；再则冰箱温度应控制在2～4℃，尽量恒温使菌体处于稳定的生理状态。

（2）穿刺液状石蜡覆盖保藏法：此法是罗氏培养基直接保藏的一种改进方法，可用于保藏结核分枝杆菌。方法是将罗氏培养基为凝固时盛入小试管或螺旋口小试管内，高度为试管的1／3。85℃凝固灭菌时不制成斜面，用接种针将菌种穿刺接入培养基的1／2处。培养后的微生物在穿刺处及培养基表面均可生长。然后以无菌液状石蜡覆盖生长表面，使液状石蜡高出培养基表面2～3mm。液状石蜡必须高压灭菌2次后，于80℃彻底烘干其中的水分。小试管被置于4℃冰箱中保存。由于保藏温度低且分枝杆菌被液状石蜡包裹而使氧气减少，从而降低了结核分枝杆菌的代谢能力，因此保藏效果较斜面为好。虽然不用穿刺法而直接将液状石蜡加入生长好的斜面上亦可得到相似的效果，但消耗的液状石蜡较多。保存期内发现液状石蜡减少应及时补充。穿刺液状石蜡覆盖法虽然简便，但却不适宜保藏非结核分枝杆菌（non－tuberculosis mycobacteria，NTM），特别是速生型分枝杆菌菌株。此外，由于从液状石蜡覆盖层下移种时，接种针在火焰上烧灼时菌体会随着液状石蜡飞溅，如果实验室操作和防护条件较差时，应予注意防止操作人员被感染。另外，移种传代后第一代的培养物会因液状石蜡的残留而影响生长的程度，第二代才适合于实验用。

注意事项：结核分枝杆菌菌株培养时间不能太短，为防止菌株的过度发育，可适当让试管先置在冰箱中（2～4℃）2d后再加入液状石蜡。倒入的液状石蜡必须要超过培养基表面，过低则液状石蜡挥发后会露出培养基，从而导致培养基表面干涸，缩短了保藏时间。高压后烘烤液状石蜡应彻底，尽可能把水分蒸发干净。使用密封性较好的螺口试管防止液状石蜡蒸发影响菌种的保藏。

2．悬浮液低温保存法 悬浮液低温保存法的基本原理是将分枝杆菌充分悬浮于不含养分的溶液，如经高压灭菌的20%甘油／0．25mol／L（pH6．5）磷酸缓冲液或20%甘油／生理盐水中，保藏在－20℃。使用该方法，大部分分枝杆菌能保藏1年以上。此法的关键是要用密封性能好的螺旋口菌种管和封口膜密封管口，防止水分的蒸发。

（五）长期保存方法

此类菌株保存方法适用于仪器设备齐备（如超低温设备、真空干燥设备）、实验防护设施和相关措施较完善、开展科研和检查项目较丰富的实验室采用。为保证被保藏的细菌，在经过长期、低温冷冻保存后能够移种传代复活，一般每支保存管中要求的细菌数量在108～1010个（≥10mg）。

1．悬浮液超低温保存法 将10mg分枝杆菌充分悬浮于冻存溶液（如3g或6g胰蛋白胨溶于100ml 20%或40%甘油水溶液）或7H9培养基（含抗生素混合物PANTA）中，保藏温度为－70℃。使用该方法，大部分分枝杆菌能保藏5年以上。此法的关键是要用密封性能好的螺旋口菌种管防止水分的蒸发。

2．液氮保藏法 液氮罐在目前来说实验室较容易购置。用液氮罐来保藏菌种，效果好、方法简单、保藏的对象也最为广泛。其方法是将菌悬液加入灭菌后的保护剂（终浓度为10%的甘油水溶液或5%二甲亚砜水溶液）中。许多细菌可保藏超过4年。此方法操作简便但无菌要求较高，且保存的菌株数量受到保藏容器的限制。

3．梭－氏（Sordelli）真空干燥保藏法 此法的基本原理是将小试管中的菌悬液，不经过冷冻而直接抽干保藏。一般用8mm×60mm有棉塞的小试管，加入悬浮于保护剂中的菌悬液。悬液中细菌的浓度应高，而加入小试管的数量应少，一般每管不超过0．5ml。将小试管振荡使悬液黏附于管壁，贴上标签后，放入12cm×150cm的大试管中，大试管底部加入少量五氧化二磷和几粒小玻璃珠使小试管不直接与干燥剂接触。大试管的口上配有中间插有玻璃管的橡皮塞。将真空泵与橡皮管连接，抽真空至0．05Torr（1Torr＝133．322Pa）左右。可以用石蜡将橡皮塞和玻璃管全部封住，也可以在橡皮塞下部将大部试管拉细，第二次抽真空熔封。在5℃低温下保藏时，NCTC曾报道保藏了2 724个菌种，14年后的存活率为83%。

4．冷冻干燥保藏法 用这种方法保藏菌种已有几十年的历史，由于它具有保藏期长、变异小、便于大量保藏及适用范围较广等优点，是各保藏机构使用的主要方法。曾有报道ATCC保藏的6 500个菌种中只有不到100个无法用这种方法保藏，病原菌中的98．5%适用，仅有一些不产孢子的丝状真菌不宜用此法。其基本原理是将微生物或孢子冷冻，然后在减压情况下利用升华现象除去水分，使细胞的代谢、生理等生命活动处在停止状态下进行长期保藏。此法可用小箱式或多孔道的冷冻干燥机进行，亦可自制较简单的装置进行。它的操作步骤比较复杂且需要经过系统培训的人员完成操作，下面分别叙述。

（1）保存菌种要求：作为长期保藏的菌种，应当选择最适培养基和温度以便得到良好的培养物。培养时间要掌握在生长后期，因为对数生长期的细菌对冷冻干燥的抵抗力较弱。从理论上说，最好是用生理盐水或缓冲液将斜面上刮下的菌体清洗数次，以期去除培养基中可能带来的各种物质。但在实际操作中如果洗净的条件不适宜会使细胞受损，同时也增加了污染的可能性，一般都省略了这一步骤。操作时先将少量分散剂（保护剂）加入斜面中，轻轻刮下菌苔或菌落，注意不要划破斜面而带入培养基，刮下的菌苔或菌落使用生理盐水或缓冲液制成均匀的菌悬液。菌悬液的细胞浓度，可保持在109～1010／ml。如果用液体培养，则在离心后除去上清液，每10ml所得的菌体可加入1～2ml的保护剂。这个步骤中必需严格的遵守无菌操作和检验培养的程序，因保藏期较长，培养物不纯或操作污染都会造成不良的后果。制成悬液后即在同样严格的无菌条件下用毛细滴管加入灭菌好的安瓿管中，每个安瓿管容量为0．1～0．2ml，但不必准确控制。

（2）安瓿管的准备：冷冻干燥用的安瓿管形状不一，有的是直形小管，有的在底部带球形。安瓿管的内径为8～10mm，长度不小于100mm。安瓿管的玻璃要求中性、能耐热、耐压、耐温度的骤变和管底厚度均匀，先用毛细滴管加入洗液浸泡过夜，第二天用水及蒸馏水洗净后干燥，瓶口加脱脂棉塞用纸包好，在121℃灭菌30min后，再在60℃烘箱中干燥。干燥温度不宜过高以防止脱脂棉被烤焦。

（3）保护剂：或称分散剂，其作用有二。一是使细菌悬浮其中保持活的状态；二是减少冷冻干燥时对微生物引起的损伤。保护剂大致可分为低分子化合物如氨基酸、有机酸、糖类等；高分子化合物，如蛋白质、多糖等，原则上是二者配合使用的。ATCC一般使用马血清、NCTC用1∶3的营养肉汤和马血清加入7．5%的葡萄糖。最常用的是脱脂牛乳和血清。最简单的是将普通牛乳离心后除去上层乳脂，常压灭菌3次、每次1h，温度过高将影响保藏的效果。血清要过滤灭菌，牛乳可加热灭菌且冷冻干燥后易形成均匀粉末故更为常用。

（4）冷冻：装入菌悬液的安瓿管应立即冷冻，不宜放置过久。时间长了会使用菌体自行沉淀成为不均匀的悬液而不利冷冻，同时还会使保护剂起培养基的作用使微生物再次生长并繁殖，这些情况都不利于长期保藏。一般冷冻的温度达到－30℃以下即可，有冷冻干燥机的可在冷冻架上进行，否则用一个盛有干冰的广口热水瓶将安瓿管在干冰中转动几下即可。冷冻后的安瓿管应立即真空干燥。

（5）真空干燥：真空干燥可用小箱式的冷冻干燥机，冷冻结束后立即启动真空泵，在15min内使小箱内真空度达到0．5Torr，1Torr的真空度约为1mmHg（1mmHg＝133．322Pa）以上。随着真空度上升至0．1Torr以上，可以升高箱板的温度，使小箱内的温度升至25～30℃。此时由于升华还在继续，样品不会融化而能达到干燥的目的。如果有后干燥装置，可以利用油泵进行后干燥，真空箱内的真空度可达到0．01Torr以上，干燥效果更好。干燥完毕后关闭真空泵、排气、取出安瓿管将管颈拉细，再装在多孔管道上抽真空和融封。这种装置每次可冷冻干燥大量安瓿管，干燥度和真空度都较高，每次需要的时间较长约在10h以上。

另有一种带离心机的冷冻干燥机，其主要区别是在真空箱内装有一个可插入安瓿管口棉塞，插入预冷至－50～－30℃的小箱内离心机上。启动离心机及真空泵，约15min后真空度达0．1Torr时，样品已被冷冻。此时关闭离心机将样品抽干，如有加温装置，则在关闭离心机后逐步加温至25～30℃使样品加速干燥，这种装置可在数小时内完成全部过程。它的主要优点是在离心作用情况下抽真空，不会产生泡沫而影响冷冻干燥的效果，但是安瓿管数受离心插头号的限制和污染的机会较多，并不常被采用。冷冻干燥的装置还有钟罩式等，其基本原理与操作均相同，不一一列举。

（6）安瓿管的熔封：熔封必须在第二次抽真空情况下，在多孔管道上进行。一般使用2或3个喷嘴的煤气灯并由空气压缩机送入少量氧气。熔封技术需很熟练，因为既要达到熔封完全无任何泄漏，同时又要求外观完整均匀。熔封是在棉塞下部安瓿管已拉细处。

（7）安瓿管的保藏及影响保藏因素：安瓿管可放在冰箱内在4～5℃低温下保藏，保藏期为5～10年。室温保藏的效果不佳。影响保藏期的因素很多，菌种、菌龄、冷冻干燥过程中各个环节都与之有关。保藏期和菌种变异的关，在冷冻干燥中主要是由于干燥样品中含水量的影响。通常含水量在1%～3%时较好，5%～6%就会相应降低，虽然不一定进行含水量的测定，可用目测或真空度来控制，但应当引起必要的注意，此法保藏的菌种可以长期保藏菌种的稳定。有报道将保藏10年的12个属的细菌进行生理、生化、血清学的测定而没有发生变异，许多生产用的放线菌生理、生化、血清学的测定而没有发生变异，许多生产用的放线菌等微生物菌种亦都采用这种保藏方法达到长期保存的目的。

（8）安瓿管的启封：启封时，在无菌条件下，将溶封口处在火焰上稍加热，立即加上1～2滴无菌蒸馏水或用酒精棉球轻擦一下，使玻璃管产生裂缝，稍予轻击即可断落。加入最适生长的液体培养基少量使管内干燥粉末溶解，即可接种在斜面或液体培养基内，一般也使用经过复壮的第二代菌种。

四、目前存在主要的问题和解决的对策

目前，我国尚没有全面、系统地开展分枝杆菌菌种收集、鉴定和保存的实验室，少数已开展此项工作的实验室也仅限于收集和保存部分科研工作所需或某一地区的临床分离分枝杆菌菌株。已经或将要开展此项工作的实验室，在建立和运行分枝杆菌菌株库的过程中，曾经或将要遇到以下方面的问题。

（一）菌株收集的盲目性

目前一些实验室菌株库中保存的菌株除少数种类的分枝杆菌标准菌株外，绝大对数保存的是对科研、检验技术、临床诊疗和流行病学缺乏利用和参考价值的结核分枝杆菌菌株。这一现状不仅与菌株库的主要目的（即尽量采集和保存生物性状丰富的物种资源）背道而驰，也浪费了大量的财力和物力。因此，建立分枝杆菌菌株库的实验室，必须明确其相应的目的和价值。只有在此基础上，有一定目标和标准的收集、鉴定和保存相应分枝杆菌菌种，才能在今后的各项工作中发挥菌株库的作用。

（二）菌株资料的局限性

目前部分实验室在决定保存野生和临床分离的分枝杆菌菌株时，对相应菌株生物性状资料的收集、鉴定和记录不完善，特别是对相应菌株所涉及患者的临床资料和流行病学资料，很多是空白。因此，日后这些菌株在使用过程中，有可能因需要补充大量的资料而限制其应用范围。对此，唯一的解决方案就是在获得菌株的同时，收集、检测并记录一切可获得的各种相关资料，尽可能保证相应资料的完整。

（三）菌株保存方法单一

一些实验室受到各种条件的限制，仅使用一种方法保存菌株（有的可能目前采用还是不正确的方法），未根据菌株的使用频率采用多种保存方法。这样的情况如果长时间持续，势必造成保藏菌株生物性状、遗传基因特征的变化，甚至引起菌株的衰亡。因此，建议有条件的实验室菌株库，根据菌株的使用频率，采取多种适当的保存方法保存菌株。

除了上述的问题以外，许多实验室在菌株库的管理和使用制度等方面，距离国家制订的相应条例和措施上，还存在很大差距，需要进行不断的完善。