基因病理分析技术

（一）DNA印迹杂交

组织DNA经限制性内切酶消化后产生的片段用琼脂糖凝胶电泳分离。小分子量片段在凝胶中迁移速度较大分子量片段快，呈现在凝胶泳道的前部。凝胶经溴化乙锭染色后在紫外灯下可以观察照相。用氢氧化钠可消除片段之间的连接。然后用硝酸纤维膜或尼龙膜覆盖凝胶经虹吸、电转或真空泵转移印迹法将DNA或RNA转移至膜上用于杂交。

（二）杂交

杂交（hybridization）即标记的互补DNA（cDNA）探针结合到靶基因DNA或RNA上的过程，并由标记物产生放射信号或化学发光信号。杂交条件必须严格，杂交反应必须同时考虑到特异性和敏感性两个因素。

（三）DNA克隆

新的DNA片段可以被克隆即重新安装在适当的载体如质粒（Plasmid）或黏粒（Cosmid）等。把新基因或外源性DNA与质粒载体用同一种限制性内切酶切割后产生黏性末端，尔后用连接酶把两者的末端再连到一起。这种重组质粒转染细菌如大肠埃希菌后，经适当抗生素扩增，再回收探针用于杂交。

（四）原位杂交

1.原位杂交　原位杂交（in situ hybridization）即直接检测细胞内核酸（DNA和RNA），产生的信号可以在显微镜下观察定位并明确局部组织学关系（Wilkinson，1992）。DNA或RNA探针可用核素或非核素标记，并用于染色体，细胞学以及石蜡包埋切片。妇科病理中原位杂交主要用于人类乳头状瘤病毒感染（Lewis ＆ Well，1992）。非核素原位杂交最常用的标记分子是生物素和地高辛，其特点是无毒无害和容易检测。探针杂交后用抗标记物的一抗如抗生物素和抗地高辛抗体；尔后再加一层次级抗体（二抗）。抗体上标记有检测分子，后者可以由特定的检测系统显色观察，如过氧化氢酶或碱性磷酸酶。DNA病毒探针由病毒DNA或病毒的特异性酶切片段序列以及由合成DNA序列制备。后者的单核苷酸序列，包括DNA或RNA病毒的互补序列都容易标记并作为探针。但这些合成的单核核苷酸探针因序列太短而标记物量少，用于非核素原位杂交往往缺乏敏感性。

2.荧光原位杂交　荧光原位杂交（fluorescent in situ hybridization，FISH）是分子遗传学和细胞遗传学的结合，因其快速、高分辨率和重复性好，以及简单的荧光显微镜就可分析等优点已逐渐为临床采用。荧光原位杂交技术应用生物素或地高辛标记的核酸探针，通常为DNA，可对中期染色体或对间期细胞进行杂交，杂交信号由荧光素结合到卵白素来检测生物素或抗地高辛（Van Lijnsnchoten等，1994），或直接结合到探针显示靶基因。各种商业化的探针包括染色体特异性重复序列探针、全染色体探针或位点特异性探针。荧光原位杂交可用于以下目的：识别标记染色体；染色体重排特征的鉴定；研究限制性的胎盘嵌合体；迅速估量多倍体和主要的三体。双色或多色探针的结合也可用于确定多个染色体异常和基因扩增，杂交结果可用荧光显微镜和流式细胞仪分析，局灶染色体畸变区可能和组织学异常相关（Persons等，1993）。

3.染色体原位杂交　细胞遗传学改变与越来越多的实体肿瘤的诊断及预后有关。然而细胞遗传学研究中的核型研究用于常规外科病理却很困难。因为该技术难以避免非肿瘤组织的污染，且需要新鲜标本。探针与特定染色体上重复序列DNA杂交后可在间期细胞核上显示具体的杂交点，并且可在标准条件下检测出来。因此可用原位杂交方法在石蜡包埋的组织切片上检测非分裂细胞的染色体畸变。该技术优于核型研究和流式细胞术之处在其可保持完整的组织结构，因而能确定所研究的细胞类型，使肿瘤细胞与非肿瘤细胞的区分成为可能。存在的问题是因细胞核被切断而致杂交信号相对减少，使解释整个切片中细胞核内信号数目变得困难。然而，通过对照标本的比较可减少这种影响。至今尚无标准的定量或统计方法评估染色体的数目改变。

染色体原位杂交可帮助鉴别水泡状流产与部分性葡萄胎或完全性葡萄胎。三者的鉴别非常重要，因为它们的预后和治疗手段均不同。单纯组织学诊断和区分各种葡萄胎有时很困难，因为各种程度的绒毛水肿是这些疾病的共同组织学特点。传统的核型研究发现大多数完全性葡萄胎为二倍体核型，46，XX或46，XY；而部分性葡萄胎常为三倍核型，69，XXX或69，XXY。仅有一部分水泡状流产为三倍体核型。实验室已将染色体原位杂交方法用于常规服务，其可作为一种客观手段，检测染色体的成分和数目，从而鉴别这3种疾病，如果交界性的病例呈二倍体改变，则支持水泡状流产而不是葡萄胎。进而可帮助区别那些无需进行激素检测随诊的病例，因而可节省不必要的资源消耗。染色体研究葡萄胎的预后没有价值。

应用染色体原位杂交可回顾性地检测染色体单体、染色体三体或做流产胎儿的性别鉴定。并且有助于遗传咨询，特别是反复发生流产时。用染色体原位杂交方法对新鲜绒毛标本中的间期细胞核进行染色体数目的产前普查，其效果仍受质疑，但已逐渐赢得信赖。近年来，染色体原位杂交已被用于孕卵着床前的染色体非整倍体的遗传学诊断。

染色体原位杂交亦被用于研究肿瘤间变过程中染色体复杂的数目异常，如在子宫内膜间质肉瘤中。对激素治疗无效的高度恶性间质肉瘤，常呈非整倍体染色体，大多数低度恶性间质肉瘤的恶变也与发生染色体的非整倍体有关。

（五）聚合酶链反应

聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是1985年创建的一种高效分子生物学技术，现已进入中心医院的常规诊断实验室（Templeton，1992）。此项技术可分析DNA或RNA和扩增长达10Kb的DNA片段。因聚合酶链反应非常敏感，故应严格掌握实验条件以避免本间互相污染造成假阳性。PCR的操作为加少许微量DNA入小离心管，两段特异性单聚核苷酸引物即与待扩增的特异基因DNA片段配对的碱基序列，在热变性后识别并结合靶基因，然后在DNA聚合酶的作用下延伸引物3′末端，通常20～40次循环后可产生105～106的扩增效率。已知长度的扩增产物可迅速由电泳凝胶分离识别，无需核素和印迹技术。反转录PCR是在反转录酶驱动下在mRNA模板上先合成互补DNA（cDNA），而后TaqDNA聚合酶的作用下扩增DNA，与对照比较以达到mRNA水平上表达的检测。PCR在临床分子病理诊断工作中主要有以下3种用途。

1.检测临床标本中微量的DNA，包括分析单个细胞，特别对于病原体感染病例如HPV和HIV。

2.识别遗传性疾病特异基因中新的重要突变。

3.检测分析特殊疾病中已知基因突变或多态性。

（六）单链构象多态性

检测遗传突变的方法主要有两种：一是检测已知突变；二是检测未知突变。检测已知突变主要采用限制性内切酶消化特定位点后观察有无未消化的突变位点存在，这种方法称为限制性片段长度多态性分析（restriction fragment length polymorphism，RFLP）；而检测未知突变应用最广泛的方法是将特异性基因PCR产物变性后，在聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶上分离，因含突变位点的DNA单链与正常基因DNA单链有着不同的构象。故在中性聚丙烯酰胺凝胶中迁移动速度各异，由此可判断该基因片段上存在着突变的碱基，这种检测未知突变的方法称为单链构象多态性分析（single strand conformation polymorphism，SSCP）（Grompe，1993）。一般经SSCP筛选出的突变基因片段者要经DNA序列测定分析以确定突变碱基的具体位置和性质。SSCP具有简单、相当敏感并可同时检测多个样本。缺点是阳性率仅70%～90%，检测片段长度仅为200 bp或更短。

（七）显微取样PCR

组织切片中高度怀疑的细胞或细胞团可以在显微镜下在仅苏木素染色的组织里用无菌注射针头加缓冲液润湿后刮下，粗去蛋白质后加入PCR反应体系，也可用墨汁涂抹感兴趣的组织区域后，用紫外线照射切片以破坏墨汁保护区以外的DNA。由此提取DNA后可供杂合子分析（loss of heterozygosity，LOH）、SSCP以及RFLP等的PCR反应（Zheng等，1993）。

（八）原位PCR

DNA提取物的PCR的美中不足是分子病理发现与组织学背景相分离。而原位杂交又相当不敏感，大约为20拷贝/每细胞。原位PCR（In situ PCR，ISPCR）则为结合高敏PCR与精确形态学定位原位杂交于一体的新的分子病理学技术，原位PCR方法为事先用特异性引物在切片上扩增特异性基因片段，然后再用基因探针去杂交这些扩增后的片段，可极大提高原位杂交的敏感度（Nuovo，1992）。

（九）比较基因组杂交

多数分子技术都高度集中一个靶基因或一条染色体的基因分析，而不考虑大多数未检测的基因组。最近创建的比较基因组杂交（comparative genomic hybridization，CGH）克服了这一弊端。CGH技术可以比较恶性肿瘤细胞和正常细胞中整个基因的变化和识别DNA丢失或获得的区域。具体为用物物素标记肿瘤DNA，用地高辛标记正常组织DNA，两者同时杂交于正常中期染色体。肿瘤DNA杂交能用绿色荧光的异硫氰酸荧光素FITC-avidin检出，正常组织DNA杂交能用红色荧光的罗达明荧光素rhodamine抗地高辛检出。两种颜色的荧光定量可用数码图像分析系统分析，绿∶红比率的变化反映肿瘤DNA和正常参照DNA结合到染色体位点上的数量（Kellioniemi等，1992）。

（十）DNA指纹法

基因表达产物在个体间一般来讲都是相似的，但在DNA的非转录部分却有很大的变化。广泛分布于个体基因中的许多简单串联重复序列，后者由可变数量的短重复序列组成，称为小卫星（minisatellites）。当短重复序列长度仅为2～8bp时，则称为微卫星（microsatellites）。每一个体基因组中出现的不同长度决定着个体差异。DNA指纹法（DNA fingerprinting）即用这些小卫星序列核心的几个拷贝的重复序列为探针并杂交检测经限制性内切酶消化、电泳分离后的DNA片段。产生放射自显影信号显示大量的杂交带，分别来自个体的双亲。但这种多态性程度如此之高以至于每一个体都不相同。DNA指纹法可用于人血或组织样本鉴定个体，还可通过比较父母双亲的小卫星片段序列来确定个体的生物学双亲。肿瘤中微卫星序列的稳定性也是近年来研究的热点，可能与肿瘤的发生和预后有关（Jefferys等，1985）。