流式细胞仪的原理和结构

第一节　流式细胞仪的原理和结构

一、流式细胞仪的工作原理

流式细胞仪只能检测单细胞或微粒的信号，一般是将待测的微粒进行荧光染色后制成悬液标本，在一定气体压力下将待测样品压入流动室，用不含细胞或微粒的缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测细胞或微粒流成一定角度，使鞘液包绕着细胞或微粒高速流动，形成一个圆形的流束（即鞘流），待测细胞在鞘液的包裹下单行排列，依次通过流式细胞仪的检测区域（图8－1）。

流式细胞仪通常以激光为激发光源，经过聚焦整形后的光束垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下产生散射光和激发荧光。这两种信号同时被前向光电管二极管和90°方向的光电管倍增管（PMT）接收。散射光信号包括前向散射（forward satter channel，FSC），这种信号反映了与激光照射方向平行的细胞散射光，反映细胞对光的衍射能力，与被测细胞的大小有关，细胞大，FSC强，通过光电二极管收集前向光强。90°散射光又称侧向散射（side scatter，SSC），是指与激光束－液流平面垂直的散射光，与激光束正交90°方向的散射光信号。SSC反映细胞对光的折射、反射能力，与细胞形状、内在结构有关。细胞内结构越复杂，SSC就越强，通过光电倍增管收集侧向光强。荧光信号的接收方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其细胞内、核内物质的浓度，经过光电管倍增管接收后可转换为电信号，再通过模数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。计算机采集所测量到的各种信号进行处理，将分析结果显示在计算机上，或是打印出来或以数据文件形式储存。

流式细胞仪还具有细胞分选的功能。细胞的分选是通过分离含有单细胞的液滴而实现的。在流动室的喷口上配有一个超高频的压电晶体，充电后振动，使喷流出的液滴断裂为均匀的液滴，待测细胞就分布于这些液滴之中。将这些液滴充以不同的电荷，当带电液滴流经充有高压电的偏转板时，在电场作用下偏转，落入各自的收集容器中，不予充电的液滴落入中间的废液容器中，从而实现细胞分离（图8－2）。

图8－1　流式细胞仪的工作原理

图8－2　细胞分选

二、流式细胞仪的结构与分类

（一）流式细胞仪的组成

1.流动室和液流驱动系统　使细胞排成单列与激光垂直相交，且保证每个细胞通过此相交点的时间相等。

2.激光光源及光束形成系统　提供单色性好、功率高、有较高的稳定性的光源，并保证样品中细胞受到的光照强度一致，且相交点与激光束正交于激光能量分布的峰值处。

3.光学系统　由若干组透镜、滤光片和小孔组成的光学系统，将细胞产生的散射光和不同波长的荧光信号送到不同的电子探测器。其中起主要作用的是滤光片，主要有3种类型：长通滤片（Long－pass），如LP500，即＞500nm光可透过；带通滤片（Band－pass），如BP500/50，即475～525nm光可透过；短通滤片（Short－pass），如SP560，即＜560nm光可透过。

4.信号检测与存储、显示和分析系统　当细胞携带荧光素标记物通过激光照射区时，受激光激发产生代表细胞内不同物质、不同波长的荧光信号，这些信号以细胞为中心，向周围空间发射，产生散射光和荧光信号。由光电二极管、PMT将光信号按比例转变为电子电压脉冲信号（高度、宽度和面积）以数码信号储存在计算机里。

5.细胞分选系统　将指定的细胞从细胞群中分离出来。

（二）流式细胞仪的分类

1.临床型台式机　有FACScan、FACSCalibur及FACSort等型号，其特点是仪器的光路调节系统固定，自动化程度高，操作简便，易学易操作。

2.科研型大型机　其特点为分辨率高可快速分选细胞，并将单个或指定个数的细胞分选到特定的培养孔（培养板）上，同时可选配多种波长和类型的激光器，适用于更广泛、更灵活的科学研究应用。

3.新型流式细胞仪　随着激光技术的发展，仪器选用2～4根激光管，最多检测13个荧光参数，加上散射光信号可达15个参数同时分析。可实现高速分选（每秒钟5万个细胞）和遥控分选，满足多种科学研究的需要。

（三）流式细胞仪的主要技术指标

1.荧光测量的灵敏度　＞600个荧光分子，衡量仪器检测微弱荧光信号的重要指标。

2.前向角散射光检测灵敏度　指能够检测到最小颗粒的直径，最小可测量到颗粒直径为0.2～0.5μm。

3.仪器的分辨率　用变异系数CV值表示，CV＝SD/Mean×100%，衡量仪器测量精度的指标。CV值越小，测量的误差就越小，一般流式细胞仪在最佳状态时CV＜2%。

4.分析速度　以每秒可分析的细胞数目来表示，一般为每秒3000～6000个细胞，大型机可达每秒几万个细胞。

5.分选指标　用于细胞分选条件设定。主要包括：分选速度、分选纯度及分选收获率。分选纯度是指被选出的细胞所占的百分比，一般台式机和大型机分选纯度可达99%。分选收获率是指被分选出的细胞与原来溶液中该细胞的百分比，通常分选纯度和收获率是相互矛盾的，即纯度高，收获率低。