植物基因组的提取和酶切

实验一　植物基因组DNA的提取和酶切

一、实验目的

了解植物总DNA的抽提方法，掌握抽提植物总DNA的基本原理;学习根据不同的植物和实验要求设计和改良植物总DNA抽提方法，制备高质量的基因组DNA，用作PCR扩增的模板，还可用于构建基因组文库以及进行Southern印记杂交。

二、实验原理

植物细胞外有纤维素细胞壁包围，因此常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞。由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)，对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。也可以加入提取缓冲液后在冰上研磨。

十二烷基肌酸钠(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammonium bromide，简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称SDS)等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。一般DNA或RNA的提取要经过饱和酚、饱和酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)、氯仿-异戊醇三步提取，或者直接用后两步提取。酚与氯仿的水溶性不同，对蛋白质的变性作用也不同，对其他杂质的溶解性也不同。同时酚是环状结构，能够插入核酸分子之中，影响后续的酶反应，而酚与氯仿互溶，用氯仿可以清除酚的污染。所以，酚与氯仿的三步处理法可以较充分地使蛋白质变性，并使含有DNA的水溶液与含有膜组成、疏水性蛋白、脂溶性色素、多酚类等其他成分的有机溶剂分开。由于DNA在0.3mol/L的高盐浓度和酸性pH值的一定浓度的醇类溶液中溶解性降低而沉淀，上清液中加入2.5～3倍无水乙醇或等体积异丙醇使DNA沉淀。离心后弃去上清液，用75％乙醇洗一次，将沉淀中的离子、脂溶性物质和有机溶剂洗去，最后用无水乙醇洗，带走剩余的水分，使沉淀容易干燥。Tris-HCl是缓冲剂，保持缓冲液中pH值为8.0，碱性状态，维持DNA双螺旋的稳定。因此沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。

由于基因组DNA是长链分子，提取过程中容易被各种物理力量切断，提取过程中要采取降低切断率的措施，如用剪口的1mL枪头吸取，混合时不要剧烈振荡等。

用于Southern杂交的原始DNA分子应达到100～150kb大小。提取出来的DNA用酶切处理后能形成较小片段，可以连接到相同酶切处理的载体质粒上。

三、实验仪器、材料和试剂

1.仪器:离心管(1.5mL、7mL)，台式高速离心机，微量移液器，枪头(1mL、200μL)，枪头盒，水浴锅，研钵。

2.材料:花生或水稻叶片。

3.试剂:2％ CTAB抽提缓冲溶液:CTAB4g　NaCl 16.364g，1mol/L Tris-HCl20 mL(pH8.0)，0.5mol/L EDTA8 mL，先用70mL ddH₂O溶解，再定容至200mL灭菌，冷却后加β-巯基乙醇到0.2％～1％(400μL)。

Tris-饱和酚，冰冷的75％乙醇，冰冷的无水乙醇。

3mol/L NaAC，pH5.2。

氯仿-异戊醇(24∶1):先加96mL氯仿，再加4mL异戊醇，摇匀即可。

四、实验步骤

(一)DNA提取详细步骤和说明

1.含有0.2％ ～1％ β-巯基乙醇的2％ CTAB抽提缓冲液在65℃水浴中预热。

2.取少量叶片(用7mL离心管提取约1g，用1.5mL离心管提取约0.25g)置于研钵中，加入3mL(7mL离心管抽提)或700μL(1.5mL离心管抽提)的2％CTAB抽提缓冲液在冰上研磨。

3.将磨碎液倒入7mL或1.5mL的灭菌离心管中，磨碎液的高度约占管的二分之一。

4.将离心管置于65℃的水浴槽中，每隔10min轻轻摇动，40min后取出。

5.冷却2min后，加入等体积Tris-饱和酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)至满管(平衡)，轻轻振荡约10min，使两者混合均匀。

6.放入离心机中6000rpm离心15min。

7.将上清液用剪口枪头转到新离心管中。

8.加入等体积的氯仿-异戊醇(24∶1)，轻轻振荡混匀，于6000rpm的离心机中离心5min。

9.用剪口移液器轻轻地吸取上清液到新管中，加1/10体积的3mol/L NaAC，pH5.2，加入等体积异丙醇，轻轻混匀，可见白色絮状DNA。

10.6000rpm离心10min后，立即倒掉液体，注意勿将白色DNA沉淀倒出，同时勿翻转离心管，直接倒立于铺开的纸巾上，直到管内无可见液体。

11.加入1mL75％乙醇轻轻转动，用手指弹管尖，使沉淀与管底的DNA块状物悬浮于液体中(也可直接加入75％乙醇后不搅动沉淀，直接离心)。

12.10000rpm离心1min后，倒掉液体，加入无水乙醇1mL后10000rpm离心1min。

13.离心后，倒掉液体，同时勿翻转离心管，直接倒立于铺开的纸巾上，等管内无可见液体后，直立离心管，干燥DNA(自然风干或真空离心机干燥10min)。

14.加入50μL0.5×TE(含RNase)缓冲液(如果产量高可加100μL)，使DNA溶解。

(二)DNA提取流程图

(三)对DNA的处理

①一管的DNA产物同时加入EcoRⅠ和HindⅢ置于37℃恒温箱约12h，对DNA进行酶切，用于基因组文库构建(选择性)。②一管只加EcoRⅠ，同时使RNA降解，用于Southern杂交。③一管只含RNA酶，用做PCR模板。

以上三管置于－20℃保存、备用。

说明:制备的基因组DNA用于下面的3个实验:

1.PCR的模板(不用酶切)。

2.基因组DNA文库的插入片段(EcoRⅠ和HindⅢ双酶切)。

3.Southern杂交的材料(EcoRⅠ酶切)。

(四)DNA质量检测

琼脂糖凝胶电泳检测，实验原理和实验步骤见附录1。

整个实验大约需要4～5h。

图1-1　CTAB法提取植物基因组DNA流程图

五、结果与分析

植物基因组DNA结果如图1-2所示。基因组分子量很大，能够在琼脂糖凝胶中分离的最大片段DNA分子量根据凝胶浓度而定(见附录1)，一般检测性的凝胶浓度在0.7％～1.2％，分子量很大的DNA在胶孔中跑不下来。一般的基因组DNA提取操作过程都会造成大分子DNA链的断裂，因此凝胶中呈现弥散状带型。双酶切以后，由于基因组DNA序列的多样化，带型也呈弥散型。只有非常小心提取的基因组DNA不呈弥散状，但其大片段留在加样孔中，除非采用0.3％浓度的琼脂糖凝胶在低温下分离。

图1-2　植物基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图

六、注意事项

1.叶片磨得越细越好，由于植物细胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外，第一步的操作应迅速，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出DNA酶，使DNA降解。

2.注意移液器的使用。

3.操作过程中应避免高速旋转和剧烈振摇造成的DNA线状分子的断裂。

七、思考题

1.实验中所用到的各试剂的作用是什么?如:CTAB，氯仿，异丙醇，75％乙醇，EDTA。

2.提取基因组DNA时应注意哪些问题?