Ⅰ基因片段序列分析

表13为三疣梭子蟹3个野生群体COI基因片段的遗传多样性参数结果，可见日本北海道群体的各项遗传多样性参数值较高，韩国东海岸群体次之，我国会场群体的遗传多样性参数值较低，表明我国会场野生三疣梭子蟹的遗传多样性水平较低。表14为三疣梭子蟹不同群体单倍型数量及分布，可见共出现19种单倍型（已在GeneBank中注册，注册号为GU321229-GU321244）。在3个群体中共检测到33个变异位点，包括17个单一变异位点、15个简约信息位点和1个插入/缺失位点。共有转换21个，颠换11个，转换/颠换为1.909。不同群体各碱基含量基本一致，A、T、G、C含量平均为26.3%、36.6%、16.5%、20.6%，A1T含量明显高于G1C含量，符合无脊椎动物线粒体DNA序列特征。表15为基于COⅠ基因片段计算的三疣梭子蟹种内和种间遗传距离结果，可见三疣梭子蟹种内遗传距离为0.000-0.020，平均遗传距离为0.006，种间的遗传距离在0.168-1.538之间。图7为三疣梭子蟹COⅠ基因序列分子进化树，可见三疣梭子蟹不同的单倍型先聚在一起，再和梭子蟹属的远海梭子蟹及塞氏梭子蟹相聚，然后和青蟹属的2种蟹相聚，最后和日本聚在一起。

图6　三疣梭子蟹不同单倍型及其他5种蟹的COI基因序列比较

注：“-”表示插入或缺失；“.”表示相同的碱基。

表13　三疣梭子蟹3个野生群体COI基因片段的遗传多样性参数

表14　三疣梭子蟹不同群体单倍型数量及分布

表15　基于COI基因片段计算的三疣梭子蟹种内和种间遗传距离

图7　三疣梭子蟹COⅠ基因序列分子进化树

本实验得到的三疣梭子蟹3个群体2个基因片段各碱基组成基本一致，A1 T比例也相差不大，分别为70.7%、62.9%，相差不大。A1T的含量明显高于G1 C。该结果与许多研究者在贝类、甲壳类、头足类等线粒体基因中观察到的结论一致（孔晓瑜等2001；高天翔等2000）。线粒体上的不同基因具有不同的解析能力，同一基因在不同的物种间解析能力也不同（李咏梅等2009）。在线粒体基因组中，12S rRNA和16S rRNA基因进化速率低、比较保守，而CO Ⅰ基因在不少无脊椎动物中检测到了较大的变异（Howland et al.1995；Spicer et al.1995）。Meyran 等（1997）认为，在近缘种类的鉴定上，CO

Ⅰ序列比16S rRNA基因序列更灵敏。从本实验结果可以看出，在16S rRNA基因中，3个群体共检测到4个变异位点，而COⅠ基因检测到33个变异位点，由此可见，CO Ⅰ序列呈现较丰富的变异，可用于群体内遗传多样性分析。同时COⅠ基因也更适于种群遗传学和种间差异的研究。

本书对3个群体进行了聚类分析，从遗传距离分析来看，我国会场群体和日本北海道群体的平均遗传距离为0.006，与韩国东海岸群体的平均遗传距离为0.005，韩国东海岸群体与日本北海道群体的平均遗传距离为0.007。单倍型研究发现，16S rRNA基因片段产生3个单倍型，COI基因片段产生19种单倍型，从所产生的单倍型及与其他种的分子进化树可以看出，3个群体的所有单倍型先聚在一起，再与红星梭子蟹（Portunussanguinolentus）和远海梭子蟹（Portunus pelagicus）聚在一起，然后与锯缘青蟹（Scyllaserrat）和拟穴青蟹（Scylla paramamosain）聚在一起，最后与日本（Charybdisjaponica）聚在一起，该结果与传统分类学一致（戴爱云等1986；金珊等2004）。而基于16S rRNA基因片段构建的NJ系统树所反映的分类关系与基于COI基因片段构建的系统树并不一致，主要不同在于的分类关系上，基于16S rRNA基因片段构建的NJ系统树显示出梭子蟹科的3个属聚为两大支：三疣梭子蟹不同的单倍型先聚在一起，再和梭子蟹属的远海梭子蟹及塞氏梭子蟹（Portunussayi）聚为一支。而青蟹属的三种蟹先聚在一起，再和日本聚为一支。在本研究中，16S rRNA和CO Ⅰ基因片段得到的系统树，种内与外群的趋势出现了不一致。原因可能是两个片段的进化速率不一样造成的，因此今后应选择线粒体DNA的其他基因区域（如COⅡ、ND5等）进行研究，以得到更多的DNA序列数据。另外从本实验结果可以看出，利用线粒体COⅠ基因检测到的三疣梭子蟹群体遗传多样性水平显著高于基于线粒体16S rRNA的结果，可见由于分子标记进化速度不同所能检测到的多样性水平有一定的差异。今后，笔者拟通过微卫星或AFLP技术进一步在核基因水平上进行群体遗传结构的研究，为三疣梭子蟹优良种质的筛选提供更全面的理论基础。

（作者：高俊娜，刘萍，李健，潘鲁青，高保全，陈萍）