聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白

实验四　聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白

实验目的

（1）学习聚丙烯酰胺凝胶电泳的实验原理。

（2）掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作技术。

实验原理

聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶为载体的一种区带电泳。该凝胶由丙烯酰胺（Acr）和交联剂N，N′-甲叉双丙烯酰胺（Bis）聚合而成。

Acr和Bis单独存在或混合在一起时是稳定的，但具有自由基团体系时就能聚合。引发自由基团的方法有化学聚合和光聚合两种。化学聚合的催化剂是过硫酸铵（Ap），加速剂是四甲基乙二胺（TEMED）；光聚合是以光敏感物核黄素来代替Ap，在紫外光照射下引发自由基团。采用不同浓度的Acr、Bis、Ap、TEMED使之聚合，可产生不同孔径的凝胶。因此可按分离物质的大小、形状来选择不同浓度的凝胶。

聚丙烯酰胺凝胶电泳的高分辨率表现在以下三个方面。

1.浓缩效应

样品在电泳过程中首先通过浓缩胶，在进入分离胶前被浓缩成一样品薄层。这是由于在电泳缓冲液中主要存在三种阴离子，即Cl^-、甘氨酸以及蛋白质，在浓缩胶的pH值下，甘氨酸只有少量的电离，所以其电泳迁移率最小，而Cl^-的电泳迁移率最大。在电场的作用下，Cl^-最初的迁移速度最快，这样在Cl^-后面形成低离子浓度区域，即低电导区，而低电导区会产生较高的电场强度，因此Cl^-后面的离子在较高的电场强度作用下会加速移动。达到稳定状态后，Cl^-和甘氨酸之间形成稳定移动的界面。蛋白质由于聚集在甘氨酸和Cl^-的界面附近而被浓缩成很窄的区带，所以在浓缩胶中Cl^-是快离子（前导离子），甘氨酸是慢离子（尾随离子）。

2.电荷效应

当甘氨酸到达分离胶后，由于分离胶的pH值（通常pH＝8.9）较大，甘氨酸解离度加大，电泳迁移速度变大，赶上了Cl^-，电位梯度消失，这时蛋白质在分离胶中以本身的电泳迁移速度进行电泳，向阳极移动。电荷的多少决定了泳动速度。

3.凝胶的分子筛效应

蛋白质进入分离胶后，由于聚丙烯酰胺的分子筛作用，小分子的蛋白质可以容易地通过凝胶孔，阻力小，迁移速度快，大分子蛋白质则受到较大的阻力而迁移速度慢，这样蛋白质在电泳过程中就会根据其各自相对分子质量的大小而被分离。

这三种物理效应，使样品分离效果好，分辨率高。

聚丙烯酰胺凝胶电泳所用电泳槽有圆盘和垂直板之分，但两者的原理完全相同。

实验试剂与实验器材

1.实验试剂

（1）分离胶缓冲液（pH值为8.9的Tris-HCl缓冲液）：取1mol／L盐酸48 mL，Tris　36.3g，TEMED　0.23mL，用去离子水溶解后定容至100mL，用棕色瓶在4℃条件下保存。

（2）分离胶贮存液：28g　Acr，0.735g　Bis，用去离子水溶解后定容至100 mL，将不溶物过滤去除，置于棕色瓶在4℃条件下保存。

（3）0.14%过硫酸铵溶液（很难保存，现配现用）。

（4）浓缩胶缓冲液（pH值为6.7的Tris-HCl缓冲液）：取1mol／L盐酸48 mL，Tris　5.98g，TEMED　0.46mL，用去离子水溶解后定容至100mL。

（5）浓缩胶贮存液：10g　Acr，2.5g　Bis，用去离子水溶解后定容至100 mL，置于棕色瓶在4℃条件下保存。

（6）40%蔗糖溶液。

（7）脱色液：7%乙酸溶液。

（8）电泳缓冲液（pH值为8.3的Tris-甘氨酸缓冲液）：称取Tris　6g，甘氨酸28.8g，用去离子水溶解后定容至1L，用时稀释10倍。

（9）0.1%溴酚蓝溶液。

（10）染色液：称取考马斯亮蓝R250　0.5g，磺基水杨酸200g，加去离子水使其完全溶解，定容至1　000mL。

（11）0.004%核黄素溶液。

（12）人血清。

2.实验器材

垂直板电泳槽、直流稳压电泳仪、移液管（1mL、5mL、0.5mL、0.1mL）、烧杯（100mL）、细长头的吸管、微量注射器等。

实验步骤

（1）安装垂直板电泳槽：将密封用硅胶框放在平玻璃上，然后将凹形玻璃与平玻璃重叠，用胶布将下侧封住，用夹子将两块玻璃固定。

（2）分离胶制备：按照分离胶缓冲液、分离胶贮存液、水、0.14%过硫酸铵溶液体积比为1∶2∶1∶4的比例配制一定体积的7.0%凝胶溶液。混合均匀后的凝胶溶液，用注射器加至长、短玻璃板间的窄缝内，加胶高度为距样品模板梳齿下缘约1cm。在凝胶表面轻轻加一层重蒸馏水（高度为3～4cm），用于隔绝空气，使胶面平整。30～60min后，分离胶完全聚合，可看到水与凝固的胶面折射率不同，用滤纸吸去水层。

（3）浓缩胶制备：按照浓缩胶贮存液、浓缩胶缓冲液、40%蔗糖溶液、0.004%核黄素溶液体积比为2∶1∶4∶1的比例配制一定体积的2.5%凝胶溶液，混合均匀后用注射器将凝胶溶液加到长、短玻璃板的窄缝内（分离胶上方），距短玻璃板上缘0.5cm处，轻轻加入样品槽模板。用光照射40min，放置60min，待浓缩胶凝固后，轻轻取出样品槽模板，然后取下玻璃胶室，去掉密封用胶布，将玻璃胶室凹面朝里置入电泳槽。

（4）加样：将电泳缓冲液加至内槽玻璃凹口以上，取等体积人血清样品、40%蔗糖溶液以及少量0.1%溴酚蓝溶液混合后，用微量注射器将上述混合液通过电泳缓冲液小心地将样品加到凝胶凹形样品槽底部，待所有凹形样品槽内都加了样品，即可开始电泳。

（5）电泳：将直流稳压电泳仪开关打开，开始时将电流调至10～20mA。待样品进入分离胶时，将电流调至30mA左右。当蓝色染料迁移至底部时，将电流调至0mA，关闭电源。取出玻璃板，用刀片轻轻将一块玻璃撬开移去，在胶板一端切除一角作为标记，将胶板移至大培养皿中染色。

（6）染色：将凝胶放入考马斯亮蓝R250染色液中，使染色液没过胶板，染色30min左右。

（7）脱色：弃去染色液，将凝胶置于脱色液中，并经常更换脱色液，直至蓝色背景褪去。如用50℃水浴或脱色摇床，则可缩短脱色时间。

（8）记录结果。

注意事项

（1）若样品为水溶液，则应将样品溶解液的浓度提高一倍，然后与等体积样品溶液混合。

（2）用十二烷基硫酸钠（SDS）_-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子质量时，每次测定样品后必须同时作标准曲线，而不得利用另一次电泳的标准曲线。

（3）因SDS可吸收考马斯亮蓝染色液，故染色前先用脱色液浸泡凝胶条，洗去SDS，可使染色及脱色时间缩短，并使蛋白质带染色而背景不染色。

思考题

（1）简述聚丙烯酰胺凝胶聚合的原理。如何调节凝胶的孔径？

（2）上、下两槽的电泳缓冲液在电泳后，能否混合存放？为什么？

（3）为什么样品会在浓缩胶中被压缩成层？

（4）本实验中蔗糖溶液及溴酚蓝溶液各有何用途？