培养细胞的形态学观察

培养细胞的形态学观察_组织工程学实验技

一、活细胞观察

细胞培养法允许实验者在细胞培养的不同阶段，进行观察和纪录活细胞的变化过程。最常用的观察记录方法是相差显微镜观察和摄像。

培养的活细胞在一般显微镜下观察时，细胞是透明的，反差小，难以观察到细胞清晰结构，只有应用相差装置的显微镜，才能使目的物与背景反差增强，能够看清细胞的轮廓和一些微细结构如线粒体、核仁、染色质等（图3－1）。

图3－1　人成骨肉瘤细胞株MG－63体外培养的相差显微镜观察　×150

相差显微镜的相差装置或显微镜都由两个主要部分组成：相差聚光器和相差物镜。在每个相差物镜的光学系统中都有一个光环透镜；在聚光器里有数个可转换的相位板，一定倍数的物镜使用时须与相应的相位板一致。相差观察时对照明要求严格，光轴要对正，视野照明光度均匀。

【操作步骤】

1．先调好相位板，使聚光器相位板号与相差物镜放大倍数相一致。

2．然后抽出目镜，再换辅助望远镜，移动辅助镜筒并调整聚光器相位板，使视野中两个大小一样的光环必须相互吻合，如不同说明倍数不一致。

3．再重新换上原目镜，即成相差图像，可进行观察和摄影；当更换不同倍数物镜时，须按上述过程重新调节。

【注意事项】

（1）对培养瓶、皿的要求。相差显微镜观察要求底物要平坦、质地均匀、透光度好；一般玻璃瓶凹凸不平不适做相差观察和摄影。最好用质地均匀的塑料培养瓶。

（2）观察和摄像前要擦净培养瓶面，勿使残留污迹影响透光度。

（3）调光。对正光轴是显微摄影的重要条件，忽视时不易获得理想效果。

二、化学染色观察

培养细胞既可直接观察活细胞，也可进行固定制成永久标本进行染色观察。固定染色观察是细胞培养中常用显示细胞形成的技术，能揭示细胞的微细结构。培养细胞可用各种方法染色，有一般和特殊之分。一般化学染色观察为观察细胞一般形态之用，如常用的Giemsa染色、苏木精－伊红（HE）染色法等；特殊染色为用于观察细胞的特殊成分和结构的方法，如酶细胞化学、免疫细胞化学方法等。以下介绍培养细胞的一般化学染色观察方法。

（一）细胞培养物固定前的处理

各种细胞材料如盖片单层培养物（细胞爬片）、悬浮培养物等都可进行细胞固定。盖片条从培养瓶或培养皿中取出后经Hanks液漂洗多次，洗去血清和附着于细胞表面的死细胞残渣。悬浮细胞经低速离心去除血清，再用Hanks液清洗后，制成涂片，空气干燥。

（二）细胞固定

细胞固定的目的在于迅速终止组织内种酶的活性，防止细胞自溶，保持细胞完整的形态结构，使细胞内化学物质和酶能准确定位。常用的固定试剂为甲醇、乙醇、丙酮、冰醋酸、甲醛、戊二醛、重铬酸钾、锇酸等，分别以不同的剂量单用或混合配制。以下为常用的几种固定液：

1．10%甲醛溶液　甲醛100ml，蒸馏水900ml。

2．10%中性甲醛（pH　7．2）　0．2mol／L Na2HPO472ml，0．2mol／L　NaH2PO428ml，甲醛20ml，加双蒸水至200ml。

3．甲醇／冰醋酸固定液　甲醇∶冰醋酸＝3∶1。

4．Carnoy固定液　无水乙醇60ml，氯仿30ml，冰醋酸10ml。

5．4%多聚甲醛　先配缓冲液：0．2mol／L Na2HPO472ml，0．2mol／L　NaH2PO428ml，加双蒸水至200ml。然后将缓冲液加温至30～60℃，加入多聚甲醛2g，搅拌，滴加2mol／L　NaOH使溶解，再以1mol／L　HCl调pH至7．2。

培养细胞层次少，固定液穿透快，固定效果好，固定所需时间短，一般只需5～10min即可。

（三）Giemsa细胞染色法

Giemsa染色是最常用的方法，它简便、快速，适用于多种细胞和染色体染色。

【操作步骤】

1．Giemsa染色液配制　称Giemsa粉0．5g、甘油22ml，在研钵内先用少量甘油与Giemsa充分混合，研磨至无颗粒；再将剩余甘油混在一起，56℃保温2h后，加入33ml甲醇，保存于棕色瓶内。临用时按1∶9比例取Giemsa染色液与pH　7．0磷酸盐缓冲液混合配成Giemsa应用液。

2．染色步骤　细胞标本清洗→甲醇固定10min→空气干燥→滴加染色液布满玻片染15min→流水冲洗3min→空气干燥→中性树胶封片→观察与摄影。

3．结果　胞核染成紫红色或蓝紫色，细胞质染成粉红色（图3－2，彩图1）。

图3－2　体外培养的小鼠胚胎成纤维细胞的Giemsa染色观察　×150

【注意事项】

1．染色时染色液应布满玻片，不要有气泡；固定后，玻片一定要干燥后染色，否则残留固定液会使局部浅染、不染或染成褐色。

2．应用染色液宜现配现用，保存时间最好不要超过48h。

3．Giesma对pH极敏感，磷酸盐缓冲液pH值要调准确；染色后的标本一定要干燥后再封片，否则中性树胶封片后，残留的水与胶作用，标本局部呈现乳白色浑浊。

4．染色完毕，不能先倒去染料后冲洗，因为染色液表面常形成一层氧化膜，若先倒去液体，氧化膜易附着片上形成污渣，不易被水冲掉，结果细胞和背景都不清晰，正确方法是：小量流水从玻片一端流下，染料漂起随流水冲走。

（四）苏木精－伊红染色

【操作步骤】

1．染色液配制

（1）苏木精染液（Mayer）：取1g苏木精溶于1000ml热蒸馏水中→加入钾明矾50g、碘酸钠0．2g，搅拌至溶→加入水合氯醛50g，柠檬酸1g，加入至沸腾5min→冷却后过滤，次日即可用。

（2）1．0%伊红染液配方：将1．0g伊红（水溶性）溶于100ml蒸馏水中。

2．染色步骤　细胞单层培养物漂洗→固定→苏木精染色5～10min→自来水漂洗→浸入稀盐酸乙醇液（用75%乙醇与1%盐酸配制）数秒后进行分色处理。脱去多余的蓝浮色，使核呈深蓝色，胞质无色或呈灰蓝色→自来水浸洗→淡氨水（400ml自来水加2滴氨水）冲洗10min以上，使细胞核蓝化→自来水浸洗→1%伊红染色液染5～10min，进行对比染色→用蒸馏水洗去玻片上的浮色→70%、80%、90%梯度乙醇脱水一次，再经95%、100%乙醇脱水两次，每次1min，浸入二甲苯两次，每次1min，树胶封固→观察。

3．结果　光镜下细胞核呈深蓝色，细胞质粉红色（图3－3，彩图2）。

图3－3　体外培养的兔软骨细胞的H．E．染色观察　×100

三、超微结构观察

培养细胞具有层次薄和材料新鲜的特点，固定时很容易穿透，固定效果很好，适于做电镜观察，以下分别介绍培养细胞的透射电镜与扫描电镜观察。

（一）透射电镜观察

【试剂】　2%～3%琼脂糖，戊二醛，75%乙醇，1%四氧化锇，pH7．2～7．4PBS缓冲液。

【操作步骤】

1．细胞悬液标本制备

（1）收集5×107／ml左右对数生长期细胞（在收集前一天换液一次）连同培养基一起置2ml塑料小管中，用Hanks液或PBS液清洗2～3次，1　000～1　500g离心10min，去上清液。

（2）沿着管壁加入2%～3%戊二醛，轻轻吹打，使细胞混悬于固定液中，4℃固定30min，用小铝片将细胞团块铲离管底，翻面继续用新固定液固定30min或更长时间，1　000g离心5min，去上清液。

（3）4℃PBS液冲洗，冲洗时间不等，一般为1～2h或过夜，离心后去上清液。

（4）离心管内加入0．1～0．5ml　2%～4%琼脂糖液（37℃），两手搓离心管，使细胞与琼脂糖液混匀，室温下冷却，形成细胞琼脂凝胶预包埋块。

（5）离心管内加适量PBS液或75%乙醇，用铝片沿管壁轻轻地将细胞琼脂糖凝胶块松动，将其移入含75%乙醇的青霉素瓶内，24h后换固定液一次，4℃保存，1年内使用。

（6）预包埋块切成1mm3大小，置1%四氧化锇4℃固定1～2h。PBS液反复漂洗。

（7）分别用50%、70%、90%丙酮脱水一次，每次10～15min；100%丙酮脱水3次，每次30min。

（8）浸入稀释包埋剂中（丙酮∶包埋剂＝1∶1），室温1h；再浸入纯包埋剂（如环氧树脂）37℃过夜。60℃固化48h。干燥器内保存备用。

（9）常规电镜样品超薄切片，铀铅染色及透射电镜观察，具体方法请参照相关文献，因篇幅有限，这里不再赘述（图3－4）。

2．细胞盖片标本制备

（1）将生长在盖玻片或聚苯乙烯盖片上的单层细胞取出，置青霉素瓶内，用4℃PBS液漂洗3次。

（2）用2%冷的戊二醛固定30min，冷PBS液漂洗3次。

（3）用1%四氧化锇固定30min。

（4）梯度丙酮脱水（50%、70%各1次，90%2次，100%3次）。

（5）浸入稀释包埋剂3ml，室温30min后换纯包埋剂1ml，2h或过夜。

图3－4　小鼠浆细胞的透射电镜观察×6　000

（6）将明胶囊装满混合包埋剂，倒盖在单层细胞上，60℃固化2h。聚苯乙烯盖片与包埋剂直接用手分离。而玻璃盖片与包埋剂一齐放入盛液氮的烧杯内片刻，迅速取出放在自来水中，二者即可分离。常规电镜样品超薄切片，铀铅染色及透射电镜观察。

（二）培养细胞扫描电镜观察

【试剂】　2%～3%戊二醛，pH7．2～7．4 PBS缓冲液，梯度乙醇（30%、50%、70%、80%、90%、95%），1%四氧化锇。

【操作步骤】

1．单层细胞盖玻片培养物漂洗后，用2%～3%戊二醛4℃固定1h。PBS液洗3次，每次10min。

2．1%锇酸固定1h，PBS液清洗3次，每次10min（锇酸一定要除净，因为锇酸本身也发射电子，影响观察）。

3．乙醇上行脱水（30%、50%、70%、80%、90%、95%），各浓度乙醇通过2次，每次15min。

4．95%乙醇保存或临界点干燥后噴金，扫描电镜观察（图3－5）。

图3－5　体外培养细胞的扫描电镜观察　×2　000

四、免疫细胞化学观察

免疫细胞化学（immunocytochemistry）是利用免疫学抗原抗体反应的原理对组织细胞内特定抗原进行定性、定位和定量研究的一种技术。此技术需预先将某种标记物结合到抗体上，借标记物的荧光或酶的有色反应、放射性或高电子密度，在光镜或电镜下进行定性、定位或定量观察。由于抗原抗体的结合是高度特异的，所以免疫细胞化学具有灵敏度高，特异性强，定位准确及应用广泛等特点。这里介绍利用免疫细胞化学方法显示培养细胞内波形纤维蛋白。

胶原蛋白（collagen）在体外培养的成纤维细胞中都有表达。使抗胶原蛋白的一抗与细胞内的胶原蛋白结合，再使生物素标记的二抗与一抗结合，然后滴加辣根过氧化物酶（horseradish　peroxidase，HRP）标记的亲和素，后者与二抗结合，通过显示HRP，最终显示了胶原蛋白。

【实验用品】

1．器材　超净工作台、CO2培养箱、倒置相差显微镜、滴管、吸管、移液管、培养皿、24孔培养板、试管架、恒温水浴锅、20μl微量加样器。

2．试剂　PBS溶液（pH7．4）；一抗；免疫学检测试剂盒；显色试剂盒。

3．材料　培养细胞飞片。

【操作步骤】

1．培养细胞飞片取出后，Hanks液冲洗，4℃冷丙酮固定，干燥30min，用PBS溶液（pH7．4）冲洗3次，每次3～5min（3× 5min）。

2．每张切片加1滴3%H2O2溶液以阻断内源性过氧化物酶的活性，室温下孵育0min。

3．PBS溶液冲洗（3×5min）。

4．每张切片加1滴非免疫性动物血清，室温下孵育10min，减少非特异性背景，不必冲洗，只须吸去多余的液体。

5．每张切片加1滴第一抗体，室温下孵育30min。入4℃过夜。

6．次日取出后，先在湿盒室温下放置20～30min，然后PBS溶液冲洗（3×5min）。

7．每张切片加1滴生物素标记的第二抗体，37℃，30min。

8．PBS溶液冲洗（3×5min）。

9．每张切片加1滴抗亲和素－HRP溶液，37℃，40min。

10．PBS溶液冲洗（3×5min）。

11．每张切片加1滴新鲜配制的DAB溶液，显微镜下观察3～10min。

12．自来水冲洗，苏木精复染，中性树胶封固。

【观察结果】　细胞质内显示棕黄色的部位即为胶原蛋白所在的部位（图3－6，彩图3）。

图3－6　体外培养的小鼠成纤维细胞胶原蛋白免疫细胞化学观察　×400