微重力细胞培养与旋转培养系统

由美国宇航局（NASA）开发研制的旋转生物反应器是模拟微重力的细胞培养系统。其主体部分为一个沿对称轴自转的圆柱形容器。该系统可以模拟实际的微重力条件，当容器中任意一个流体微元旋转1周时，引力向量的平均值是零向量。在整个1周的旋转中，虽然向量的平均值为零向量，但向量幅度的平均值正好是引力向量的幅度值，即一个重力加速度值（g）。换言之，在旋转生物反应器中，平均引力向量是零向量，但是平均引力向量的幅度值是重力加速度值（g）。而在真实微重力条件下，平均向量和平均向量幅度值都是零。基于真实微重力和旋转生物反应器中所谓的微重力之间的差异，这种模型的准确性并不清楚。但这并不影响该系统的应用。

随着美国宇航局授权使用，这种生物反应器在近年得到广泛应用。其中一个新的应用领域是用于培养组织工程化组织。使用中，待培养的工程化组织（培养物）随培养液一起绕生物反应器的对称轴旋转。如果作用在培养物上的外力与其所受重力为同一数量级，可能会发生下列情况之一：当所受重力稍大于外力时，培养物会下落至圆柱形容器最低点，靠近容器内壁；通过增加圆柱形容器的旋转角速度，提高外力，培养物会因培养液浮力作用拉离容器内壁；进一步提高外力会使培养物悬于培养液中并随之旋转。研究人员假定当作用在悬于培养液中的培养物上的外力与其所受重力相等，即所受外力的合力为零时，培养物相对于固定在旋转系统上的坐标而言是静止的。当然上述假定是近似的，只是假设培养物在旋转培养过程中相对静止，因在使用中发现，实际情况是可明显看见培养物在培养液中的滚动和平动。

这种组织培养生物反应器具备两大优点：一方面，支架限定了构建的工程化组织的形状和空间结构，允许细胞在其中发生生长和分化，同时支架降解与组织再生同步；另一方面，培养环境提供了有效的动态微环境，保证了空间均匀的细胞种植和各向同性的细胞增殖及组织再生。研究人员在搅拌条件下培养工程化软骨，发现软骨中细胞数和细胞外基质比静态培养方法多；但在模拟微重力的旋转生物反应器中培养，软骨中所含的糖胺聚糖最多。

模拟微重力的细胞培养最早见于美国宇航局约翰逊空间中心。他们用此方法培养出直径达0．5～4mm的各种细胞聚集物和微载体细胞串珠。随后又将微重力细胞培养用于将软骨细胞和聚合物支架进行复合培养，获得直径7mm、厚度3mm的软骨片。由于模拟微重力细胞培养方法是通过调节旋转容器的转动速度来满足培养物处于悬浮状态，因此提供了一种相对稳定的流体动力环境，以确保有效的营养和气体交换，同时，相对于其他动态培养方法具有较低的剪切应力。模拟微重力培养有助于软骨化组织的生长，其中含有很多圆形细胞和糖胺聚糖及胶原等细胞外基质；用此方法培养的心肌组织含有许多梭形细胞，其收缩具有自律性和同步性。这些培养的工程化组织可用于体内软骨移植及关节表面覆盖，也可用于体外研究缺氧、药物及微重力对心肌组织的影响。

一、旋转培养系统及其特点

在正常生理情况下，细胞间是相互联系的。失去这种联系将会导致疾病。这在研究正常和病理组织和器官的发生机制是很重要的。通常的二维细胞培养方法因重力的影响导致细胞间联系失常而使组织和器官不能正常生长，只能得到平的、极薄的培养产物。美国宇航局（NASA）生命中心首次研制并推出的组织／细胞三维高分化度的培养系统，其核心部分是旋转式细胞培养系统（rotary　cell culture　system，RCCS），简称旋转培养系统。该系统的圆柱状培养容器中放置细胞或组织材料，并用培养液充满整个容器。整个容器由电机驱动沿水平轴旋转。细胞及组织在水平轴内建立均质的液体悬浮轨道，从而中和了大部分的重力效应，使之处于微重力状态。培养液及细胞／组织随容器一起旋转而不与容器壁和其他部件相撞，使得细胞维持在连续的自由落体状态，以此来模拟细胞的微重力环境。在这样的微环境中，细胞能以几乎接近正常的方式进行三维生长。由于系统无推进装置、气体或液体加压装置、气泡和搅拌器，使破坏性应力降低。旋转培养系统中的细胞／组织通过膜式气体交换器来吸入氧气和排出二氧化碳。消除所有气泡，以防其漩涡对细胞的生长带来不利影响。消除破坏性应力使生成的三维组织具有与父系相同的结构和功能。其组织的培养密度为1010～1011细胞／ml；细胞的培养密度为108细胞／ml。与普通细胞培养装置相比，有以下特点。

1．高分化度　旋转培养系统使具有高分化的人体组织能在实验室中生长，以便模拟感兴趣的器官和组织，如腺体和肿瘤。

2．模拟微重力　要在体外模拟正常组织的微环境因细胞外基质太复杂和难适应环境而受阻，而细胞外基质对于调节细胞骨架和细胞核基质蛋白非常重要。旋转培养系统使分离原来在一起的细胞及细胞外基质成分的重力问题得到解决，模拟体内细胞所处的微重力状态。

3．三维细胞培养　普通细胞培养装置因要保持细胞的悬浮需要产生剪切力，这将影响细胞间或细胞与基质间的稳定，使组织和细胞集中于自身的修复，大大影响了细胞生长和其他正常生理功能。发酵罐主要用于培养大量细菌，不适于大量培养人及其他哺乳动物组织细胞，因很难把大量的细胞移植到发酵罐中，即使能够培养，所得的细胞数也有限而且很难生成组织。旋转培养系统可用于培养任何组织，而且可用于大规模生产，其细胞的成活率平均为97%而且分化度高。

二、旋转培养系统的分类

（一）旋转式细胞／组织灌注培养系统

1．基本结构　该系统由旋转细胞培养容器和外围的环路部件（蠕动泵、多歧管、氧交换器和手动阀门等）通过管道连接而成。氧气和二氧化碳交换是通过与外环相连的由硅胶材料制成的交换器提供。蠕动泵用于保证培养液的注入和排出，以便得到更新。连接于装有葡萄糖和NaOH溶液蓄液瓶的多歧管用于调节培养液的pH值。手动三通阀门用于使不需要的培养液流入到废液瓶中或实现培养液的循环。系统设计有两个独立的旋转单元，故有两个电机。一个用于驱动圆柱形培养瓶的旋转，另一个用于驱动蠕动泵以调节培养液的循环速度。控制和电源做成一个单元，它的前面板按钮可用于调节培养容器的旋转速度和控制蠕动泵的转速。速率计能显示出两个电机的转速。连接旋转基座与控制和电源单元的扁型电缆可穿过培养箱的密封条。

2．工作原理　该灌注式旋转细胞培养系统通过使整个容器沿水平方向旋转来实现容器中的细胞／组织在流体中悬浮的目的。在容器中无气泡产生，这样使抑制细胞生长的剪切应力降低。所有的流体都通过蠕动泵来进行循环，通过开启培养液的阀门和把三通阀转向废液瓶，以此来注入、抽取和灌注整个系统。通过开启葡萄糖或NaOH阀和把三通阀转向废液瓶，以此来注射葡萄糖溶液或NaOH溶液。通过关闭所有的输入阀并把三通阀转向循环系统，用于培养液的循环。用“回转器”的悬浮原理，悬浮细胞和贴壁细胞（其载体为固态支架：微载体珠粒、胶原巨珠、藻朊珠粒或PGA支架）都可在该容器中能较好地生长。组织的移植物能较好地在培养液中进行培养或修复。灌注式旋转细胞培养系统是水平旋转的、无气泡的膜扩散式气体交换的培养系统。培养液、细胞和细胞团块在容器内旋转，它们不与容器壁或任何其他易致伤的物体相碰，使之处于微重力状态。因该系统无推进器、空气升液器、气泡或搅拌器，故几乎没有破坏性的剪切应力，使得大细胞团得以在模拟的微重力环境中形成。悬浮细胞和微载体珠粒上的贴壁细胞在水平的旋转式细胞培养容器内产生一个均匀的、极低剪切力的液体悬浮轨道。随着细胞的长大，可调节旋转的速度来抵偿沉降速率。

3．系统说明

（1）系统清洗：用洗涤剂和高纯水清洗或浸泡系统中的所有部件，保证系统从一开始就达到无菌状态。

（2）泄漏测试：氧交换器及管道用吹入空气后再将浸入水中来检查，保证无泄漏；多歧管用气压表测试，在无漏洞时系统才能使用。

（3）灭菌：电机和蠕动泵用环氧乙烷气体灭菌；其他部件用高压蒸汽灭菌。

（4）加注系统：安装系统后，用无菌培养液灌注整个系统。

（5）细胞培养：将系统放入CO2培养箱，待温度平衡后，接种细胞并进行培养。

（二）旋转式细胞组织批量培养系统

1．基本结构　包括：①55ml高截面纵横比容器；②110ml圆柱形容器；③10ml高截面纵横比容器；④系统的主机单元；⑤系统的控制和电源单元。

旋转式细胞组织批量培养系统提供两种基本的旋转式细胞培养容器：圆柱形容器，呈管状，有一个中央气体交换膜芯，它是为培养贴壁细胞所设计；高截面纵横比容器，为盘状的培养容器，其内壁由氧交换膜所组成。它是为培养悬浮细胞所设计。同时也可用作贴壁细胞的培养容器。

2．工作原理　旋转式细胞组织批量培养系统也是水平旋转的、无气泡的膜扩散式气体交换的培养系统。培养液、细胞和细胞团在容器内旋转，它们不与容器壁或任何其他易致伤的物体相碰。几乎没有破坏性的剪切力，使得大细胞团得以形成。悬浮细胞和微载体珠粒上的贴壁细胞在水平的旋转式细胞培养容器内产生一个均匀的、极低剪切力的液体悬浮轨道。相比普通系统来说，该系统的一个主要的优势是进行能分化或模仿父系组织结构和功能的组织培养。实验者能得到和在人体内一样的培养产物。这些细胞生长后形成与其父系组织类似的三维组织材料。因为破坏性的漩涡和碰撞力在水平的旋转式细胞组织批量培养系统中是极小的，故这些生长是可能的。这个非常低的剪切力的培养环境对于需要通过培养来生长任何脆弱细胞类型是同样重要的。用旋转式细胞组织批量培养系统使实验者能在普通的组织培养实验室内生成非常复杂的、脆性的组织。实验者如果需要连续监测他们的细胞培养的话，可在很短的时间内进行采样而并不损伤所进行的培养。加入细胞成分、化疗成分、营养成分、化学成分或试验性的化妆品而导致细胞培养变化的结果可被严密地观测。收集培养产物非常简单，只要旋开底盖，倒出培养产物或移液管吸取。无须释放剂或使用刮器。

3．系统说明

（1）微载体的准备：通常的方法是每1ml培养液中含5mg微载体珠粒。每个微载体珠粒中含10个细胞。对于大多数类型的细胞，细胞有效接种密度2．2×105细胞／ml培养液。

（2）容器的准备：包括高截面纵横比容器或圆柱形容器。注意不要把容器的任何部件放在漂白的、酸性的或碱性的清洗溶液中，因容器会吸收这些溶液而带毒，进而破坏细胞的生长。研磨性的清洁剂或丙酮等强力有机清洁剂将损坏塑料部件，从而使容器无法使用。应严格按操作说明中所提供的清洗方法进行。把容器的所有部件放入充满用于清洗组织培养实验器皿的中性的洗涤液中，浸泡1h。氧交换膜及塑料部件上的残留物用软刷来清洗。用超纯水来连续漂洗并浸泡容器部件。把容器的部件从水中拿出，然后放置于吸垫上使其干燥。再重新组装。用100%的乙醇注满容器，浸泡24h。通过端口把乙醇倒出（先把旋锁式注射器的阀打开）。用超净水灌满容器，浸泡24h。通过端口或旋锁式注射器阀把水倒出。

（3）消毒：组装好的容器可用高压蒸汽灭菌法或用100%的乙醇注满容器，浸泡过夜。用起消毒作用的磷酸盐的缓冲液彻底漂洗以便去除乙醇的残迹。

（4）容器的条件化：把容器接到旋转基座上后，一起放入CO2培养箱内。把电源和信号单元的扁形电缆通过培养箱的密封条连到旋转基座上。电源必须放在培养箱的外面。确保旋转基座是平稳的。把最初速度置于12～14r／min。旋转容器过夜，检查是否有漏和消毒是否彻底。

（5）细胞培养：通过端口把培养液吸出。用无血清的培养液注满容器的50%，加入细胞和微载体珠粒。因血清的加入会使泡沫产生，并会加大以后去除气泡的难度，因此要去除血清。对所用的细胞进行计数或切碎原组织（每5ml培养液中有10个1mm的小块），调整细胞浓度，加入合适的清洗过的、预制的微载体珠粒（5mg／ml）来稀释细胞。用10ml的注射器把细胞／微珠／培养液通过端口注入。加入合适数量的血清并把容器用培养液灌满。把容器接到旋转基座上后，一起放入CO2培养箱内。开启电源，若对组织颗粒或在微载体上的细胞培养，把初始旋转速度置于15～20r／min；若培养悬浮细胞，则初始旋转速度置于10r／min。细胞和细胞团应该随着容器一起旋转，而不应沉淀于容器内，也不会与容器壁或氧交换膜芯相碰。当速度调好后，细胞和细胞团将沿着容器内的轨道旋转。随着细胞团颗粒体积的增加，为了抵御不断增大的贴壁细胞的沉降速率，旋转速度需要相应地增大。

（6）培养液的更换：关闭电源后马上把容器的基座卸下，在超净工作台中通过端口把培养液吸出。通常留下少部分培养液于容器中。然后通过旋锁式注射器或灭菌的滴定管来对容器加培养液。培养液须沿容器壁加入（不打扰细胞团的颗粒）。把容器接到旋转基座上后，一起放入到CO2培养箱内，开启电源，调好所需的旋转速度。

三、旋转培养系统的应用范围

由于旋转培养系统所具有的特点，使之在组织工程领域得到较为广泛的应用。

1．组织移植　用旋转培养系统培养的肝和正常的肝组织在整体上无区别，可用于局部肝组织移植。经旋转培养系统培养的人工皮肤具有极高分化度，避免了以前培养的皮肤在扩展性、灵活性和肤色的不足，使皮肤移植成为可能。

2．组织再生　经旋转培养系统培养的软骨组织，密度极高，可用于治疗关节损伤，促进软骨再生。经旋转培养系统培养的骨髓，生长情况极佳，而且可以连续增生和低温冷冻保藏，可建大型骨髓库，推行大规模的骨髓再生。

3．疾病治疗　胰岛素经旋转培养系统培养后能植入体内继续生长，无数患者可望免去长期注射胰岛素。对肿瘤组织活体取样，与自身的白细胞或淋巴细胞在旋转培养系统中混合培养，刺激或激发它们来识别和攻击肿瘤组织，然后把经激活的有杀伤力的细胞直接注入病灶，用于治疗肿瘤。

4．病理模型　在旋转培养系统中培养人的器官、腺体和淋巴结，然后使这些器官受到感染，再跟踪其生长。将药物用于被感染的经培养的组织模型上，研究其对抗疾病的效果及其对抗方式。肿瘤组织的培养有利于测试化疗药物对来自患者体内的经培养和分化的肿瘤的疗效，避免了用药的盲目性。以往的方法是在鼠的组织模型上进行的，由于物种的差异使某些肿瘤在鼠体内的生长情况并不好。在旋转培养系统中所有的肿瘤组织都可生长，避免用鼠作动物模型中存在的鼠蛋白的干扰。

5．生产生物制剂　以前丙肝疫苗效果不佳的原因之一是用来产生这种疫苗的病毒并不生长在人的肝脏中，用旋转培养系统培养的肝使产生肝炎疫苗的病毒生长在人的肝脏中成为现实。经旋转培养系统培养的高分化的人体组织，当其被刺激后能分泌有治疗作用的蛋白。经培养的神经组织产生的神经生长激素能修复脊椎的损伤。因此用这种系统可生产激素、酶和其他由人体组织产生的蛋白等基因工程产品。

四、旋转培养系统应用的局限性

旋转培养系统尽管具有很多优点和广泛的应用范围，但它存在一些局限性。首先，该系统的结构设计和工作原理决定了其培养的对象只能是各相同性的组织和器官，如软骨、肝、肺及肿瘤等，对于各相异性的组织和器官，如长段骨、肌腱、韧带等各相异性的组织和器官的培养，旋转培养系统难以模拟这些组织和器官在体内的力学微环境，因此使用效果并不理想。其次，该系统用于工程化组织或器官培养时，其支架材料的选择有限，只能选择一些质地较轻的物质，如聚合物、胶原等，较重的支架材料，如羟基磷灰石、钛合金等不能用于该系统的培养。最后，用旋转培养系统进行较长时间的工程化组织和器官培养，其中细胞能否长期保证其表型和分化特征，以及培养“成熟”的组织和器官植入体内的营养、血供及免疫学等问题都有待阐明。

因此，研制模拟体内细胞动力微环境、用于工程化组织和器官构建的仪器和装置仍然是必需的，这依赖于工程学的发展和生命科学的进步，在这方面的研究显得尤为重要，某种程度上制约着组织工程学的发展。