细胞培养干预技术

在组织工程的应用过程中，常常要研究各种外界因素对细胞形态变化及生长的影响。由于体内环境异常复杂，对体外培养的细胞进行外界刺激干预是研究细胞生理、病理现象的一种重要手段。

一、电

电刺激对细胞的生长、增殖、黏附等有明显的影响。目前对体外培养细胞进行电刺激方法主要有采用导电聚吡咯膜或用电刺激仪直接刺激。

1．导电聚吡咯膜　聚吡咯膜是一种新型高分子材料，已先后应用于促神经再生、促组织创伤修补和人工脏器替代等方面，得到了国内外学者广泛的重视和研究。其具体步骤如下。

（1）聚吡咯膜的制备：在电化学工作站中，以0．01mol／L对甲苯磺酸钠为电解液，采用单池三电极系统电化学氧化法在孔径为120目的不锈钢微孔筛上氧化吡咯单体制备聚吡咯膜。制备条件为0．05mol／L吡咯单体浓度、500s聚合时间、10mA电流强度。将制备好的聚吡咯膜用导电银胶连出导线，并以硅胶绝缘。将待刺激的细胞悬液种植于预先置入导电聚吡咯膜的24孔细胞培养板中，每孔种植1．5ml细胞悬液。

（2）电刺激：在培养液中插入不锈钢钢丝为对电极，Ag／AgCl丝为参比电极，每2d给予2h，100mV恒电压的通电刺激。分析检测电刺激对细胞的影响。

2．电刺激仪刺激　在无菌操作台，用常规1寸不锈钢银柄针灸针安装固定在30mm×30mm的培养皿底部，再将0．01%多聚赖氨酸加入到培养皿内，每皿加1ml；将培养皿置于37℃恒温箱过夜，次日除去皿内所有多聚赖氨酸液，置超净台内晾干备用。细胞接种培养一定时间后进行电刺激。刺激时采用多用电子治疗仪，固定电极正负方向，给细胞进行电刺激，每天刺激2次，每次30min（脉冲幅度为：连续波形80～120mA，频率20Hz），刺激1周左右后分析观察电刺激对细胞的影响。

二、电　　磁

电磁场可直接影响细胞的生化和生理过程。用于生物学研究的高场强电磁辐射模拟源（有界波模拟源）对培养细胞进行干预是一种敏感的研究模型。电磁辐射模拟源是一个能产生类似于空中传播的电磁脉冲的装置，由高压脉冲发生源、引线极板、产生高压电场的平行终端设备组成，它可以产生一个横行传播的电磁脉冲。对培养细胞进行电磁干预的具体步骤是：

将待检测细胞以1×106　ml的浓度接种至6孔板中（在每个孔中放置四片盖玻片后并预先用多聚赖氨酸包被处理），在37℃、5%CO2下培养爬片。进行辐射时将培养板放在辐射装置的上、下两平行极板之间，当高压脉冲启动时，即可对爬片进行实验。其实验参数为：场强6×104　V／m，脉冲上升时间20ns，脉宽30μs，频率包含0～100MHz。对爬片辐射2min，共计5个脉冲。在辐射后不同时间捞片，分析观察电磁辐射对细胞的影响。

三、应　　力

力学是组织工程和细胞工程的基础之一，常常要研究机械力对细胞形态变化及生长的影响。人们提出了多种离体培养细胞的力学实验方法，研制出不同类型和功能的实验装置，不仅可以定性地分析而且能定量地研究细胞的力学特性。以下介绍两种常用细胞力学实验方法：

1．基底拉伸法　可采用美国Flexercell公司生产的细胞拉伸加载装置Flexercell 3　000Cell　Stretching　Unit。该装置加载原理是用一个真空泵抽吸由特制弹性硅胶膜制成的培养皿底部，形成负压使培养皿底部产生拉伸变形，从而使附底生长的细胞受到机械牵张。细胞所受力值大小以培养皿底部硅胶膜拉伸变率（%）表示，拉伸率越大，表示细胞所受张应力越大。将待测细胞随机分组，每组并设立对照。加力时可设定不同的力值大小如6%、12%和24%等，加力时间可根据实验需要而定（如24h）。

2．流体剪切法　流室系统由两块有机玻璃平板和环行硅橡胶垫圈组成。硅橡胶垫圈夹于两块平板之间，可以防止渗漏，并决定流场的性质。安装后流室的尺寸为：长8．5cm，宽2．5cm，高0．3mm。流入孔和流出孔间距离为7．0cm。流室测试区可满足层流、二维流动、充分发展流动。

将待测细胞接种到载玻片（7．5cm× 2．5cm）上，待长满汇合后转移到流室的测试区。密封后进行流体剪切试验。用蠕动泵作为实验中的灌流系统提供稳定的定常流。根据实验需要，选取不同档的切应力处理细胞不同时间（如1h或2h）。流室内保持37℃恒温，整个灌流系统处于同一水平面。

四、生 长 因 子

生长因子（growth　factor，GF）是具有诱导和刺激细胞增殖、维持细胞存活等生物效应的蛋白类物质，其对促进细胞增殖、组织或器官的修复和再生都具有重要的促进作用，是组织工程的重要影响因素之一。目前组织工程领域研究和应用的一些重要生长因子有骨形态发生蛋白（bone　morphogenetic　protein，BMP）、碱性成纤维细胞生长因子（basic　fabroblast　growth　factor，bFGF）、胰岛素样生长因子（insulin－like　growth　factor，IGF）、血管内皮细胞生长因子（vascular　epithelial　growth　factor，VEGF）、表皮生长因子（epidermal　growth　factor，EGF）、神经胶质生长因子（glial　growth　factor，GGF）、血小板衍化生长因子（platelet－deriv　edgrowth factor，PDGF）、角朊细胞生长因子（keratinocyte　growth　factor，KGF）等。生长因子的效应与生长因子的来源、浓度、剂量和种子细胞来源、分化状态、培养条件及有无其他生长因子参与等多种因素有关。对细胞进行干预时需要进行反复实验才能确定产生最佳效应的各项条件。

（南方医科大学基础部　白晓春）

参　考　文　献

1　郭葆玉 ．细胞分子生物学实验操作指南 ．上海：第二军医大学出版社，1998：107－115

2　D．L．斯佩克特，R．D．戈德曼，L．A．莱因万德著，黄培堂等译 ．细胞实验指南 ．北京：科学出版社，2001：1－32

3　伍欣星，聂　广，胡继鹰 ．医学分子生物学原理与方法．北京：科学出版社，2000：369－372

4　程宝鸾 ．动物细胞培养技术 ．广州：华南理工大学出版社，2000：8－112

5　李志勇．细胞工程　．北京：科学出版社，2003：85－103

6　辛　华 ．细胞生物学实验 ．北京：科学出版社，2001：97－126

7　鄂　征 ．组织培养和分子细胞技术 ．第4版．北京：北京出版社，2001：1－32

8　J．萨姆布鲁克，D．W．拉塞尔著，黄培堂等译．分子克隆实验指南 ．第3版 ．北京：科学出版社，2002：1271－1313

9　F．奥斯伯，R．E．金斯顿戈德曼，J．G．塞德曼等著，颜子颖，王海林译 ．精编分子生物学实验指南．北京：科学出版社，1998：274－289

10 王征美，杨　键，卢荣华等 ．中枢神经细胞培养中电刺激的实验研究 ．中国康复理论与实践，2002；8（11）：664－665

11 浦跃朴，李云晖，韩运双等 ．大鼠角朊细胞导电聚吡咯膜原代培养法的建立 ．生物医学工程杂志，2001；18（3）：416－418

12 赵梅兰，曹晓哲，王德文等 ．电磁辐射诱导乳鼠大脑皮质神经元凋亡的研究 ．中华物理医学与康复杂志，2002；24（12）：743－746

13 白　灵，樊瑜波，张　明等 ．离体培养细胞的力学实验方法．生物医学工程杂志，2002；19（2）：324－328

14 侯　锐，毛天球 ．生长因子在组织工程中的应用等．国外医学生物医学工程分册，2002；25（5）：219－223

15Kwak　HJ，Lee　SJ，Lee　YH．Angiopoietin－l　inhibits　irradiations　and　mannitol－induced　apoptosis　in endothelial　cells．Circulation；2000：101：2317－2324