基因重组人的制备技术

15．3．5　基因重组人SOD的制备技术

15．3．5．1　重组人Cu，Zn－SOD的制备技术

A．重组人Cu，Zn－SOD克隆、表达与纯化（包含体）

（1）菌株与质粒。大肠杆菌JF1125，质粒pLY－4由上海医科大学宋后燕教授惠赠。

（2）引物设计与合成。

正向引物：5′……ATTGAATTCATGGCGACGAAGGCC……3′

反向引物：5′……ATTGGATCCTTATTGGGCGATTCC……3′

引物两端分别设计EcoRI和BamHI位点。

（3）rhSOD cDNA的克隆及表达载体的构建。取新鲜人肝组织80mg，用TRIZOL Reagent抽提总RNA，RT－PCR扩增rhSOD cDNA，参照Sambrook等方法构建含rhSOD cDNA的pUC19重组质粒，进行核苷酸序列分析。从阳性克隆质粒中回收rhSOD cDNA片段，与表达载体pLY－4重组，构建表达质粒，转化大肠杆菌JF1125，构建成pLY－4/rhSOD工程菌。

（4）pLY－4/rhSOD工程菌的发酵培养。pLY－4/rhSOD工程菌菌种单克隆接种于LBA种子培养液（1%胰化胨，0．5%酵母抽提物，1%NaCl，100μg/mL AMP）。于30℃下恒温培养12h，至A₆₀₀＝4．0。将pLY－4/rhSOD工程菌种子菌液按1/100（体积）比例接种于4　000mL发酵培养液（0．08mol/L Na₂HPO₄，0．02mol/L KH₂PO₄，0．05mol/L NaCl，0．02mol/L MgSO₄，1%葡萄糖，1．1mg/mL维生素B₁，0．1%NH₄Cl，0．1%微量元素溶液，pH为6．8），于5L生物反应器中发酵培养。30℃下扩增，42℃下诱导培养。离心收集pLY－4/rhSOD工程菌。经SDS－PAGE电泳分析后，－20℃下保存。

（5）pLY－4/rhSOD工程菌破菌及包含体（Inclusion Body Solution，IBS）提取纯化。pLY－4/rhSOD工程菌悬浮于破菌缓冲液（0．05mol/L PB　pH＝7．4、0．15mol/L NaCl），于高压匀质机破菌。涂片，革兰氏染色镜检，破菌率90%以上。离心收获IBS，悬浮于破菌缓冲液中，以Telfon匀浆器（Potter－Evlvehjiam）反复匀浆研磨IBS，以除去可溶性核酸及菌体膜蛋白等杂质。离心收获纯化的IBS。

（6）rhSOD蛋白的提取及复性。纯化后的IBS溶解于IBS溶解缓冲液（0．05mol/L PB　pH为7．4、6mol/L盐酸胍，0．1mol/Lβ－ME），以Telfon匀浆器反复匀浆研磨均匀。离心，以除去不溶性杂质。溶解上清液按一定比例缓慢加入复性缓冲液（0．05mol/L PB　pH＝7．4，2．5%蔗糖，0．1mol/Lβ－ME），4℃下缓慢搅拌复性。以相对分子质量截留为5kD的超滤浓缩系统浓缩样品。离心除去少量不溶性杂质。

（7）rhSOD蛋白的柱层析纯化。

①pLY－4/rhSOD蛋白的G－50凝胶过滤柱层析纯化：复性浓缩后的样品，以G－50凝胶过滤层析柱纯化，以除去小相对分子质量核酸、杂蛋白及残留盐酸胍、蔗糖等杂质。纯化洗脱过程由Waters 650蛋白纯化系统控制：流速为20cm/h；流动相为缓冲液A（0．05mol/L PB、pH为7．4）。

②rhSOD蛋白的Q－Sepharose离子交换柱层析纯化：G－50纯化后的样品用Q－Sepharose离子交换柱（Pharmacia Co，Sweden）纯化。由Waters 650蛋白纯化系统控制，流速为50cm/h；以流动相A（0．05mol/L PB、pH为7．4）、流动相B（0．05mol/L PB、pH为7．4，1mol/L NaCl）进行NaCl线性梯度洗脱。收集样品，经SDS－PAGE电泳检定为rhSOD蛋白。样品分装及冻干后4℃下保存待用。

（8）rhSOD蛋白含量测定及酶活性测定。采用Lowry法及改良的连苯三酚自氧化法。

B．重组人Cu，Zn－SOD表达、发酵及纯化（可溶性表达）

（1）总RNA的制备。取约0．4g的人新鲜胎肝组织，加入4mL的TRIzoI试剂，充分匀浆后在室温下放置5min，加入0．8mL的氯仿充分振荡，室温下放置2～3min，4℃下12　000r/min离心15min，上清液加入2mL的异丙醇，混匀后室温放置10min，4℃下12　000r/min离心10min，沉淀以75%乙醇洗一次后抽干，溶解于50μL经DEAE处理的水中，－20℃下保存。

（2）RT－PCR获取rhCu，Zn－SOD cDNA。按照cDNA合成试剂盒推荐的方法合成rhCu，Zn－SOD cDNA，以此cDNA为模板进行PCR反应，按如下参数循环40次：在94℃下变性1　min，50℃下退火1min，72℃下延伸1．5min，最后一个循环在72℃下延伸10min。PCR反应产物经1．5%琼脂糖电泳检查，可清晰见到一大小为490bp左右的扩增条带。

（3）rhCu，Zn－SOD基因在大肠杆菌中的表达（可溶性表达）。将PCR产物经Klenow酶补平，与先经EcoRV酶切过的Pbs－KS质粒相连接，转化大肠杆菌TG1，通过BamHI和HindIII双酶切鉴定含有插入片段的重组质粒，将克隆在Pbs－KS质粒中的rhCu，Zn－SOD cDNA以NcoI、HindIII双酶切，低熔点胶分离后与同样经NcoI、HindIII双酶切的表达载体pET－22a（＋）相连接，构建表达质粒pET22SOD。将此表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），筛选表达菌株。将含表达质粒的单克隆菌在37℃LB培养基中（含氨苄青霉素100u/mL）培育至A₆₀₀＝0．5～1．0时，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，500mol/L的Cu^2＋和100μmol/L的Zn^2＋诱导培养5h，收集菌体。

（4）工程菌的发酵。

①培养基：LB培养基。

②培养方法：斜面种子于37℃下培养24h，待斜面长好后放入4℃下的冰箱保藏。

摇瓶斜面培养。在250mL摇瓶中装有100mL种子培养基及100μg/mL氨苄青霉素，接入斜面种子，于37℃下，200r/min离心，培养12h。

③发酵培养。重组菌发酵培养通常在5L或10L全自动发酵罐中进行。培养温度控制在37℃，通气量1∶1，pH＝6．5左右，溶氧控制在25%以上，诱导剂为异丙基3－D－硫代半乳糖（IPTG）。接种量2%，初始pH为6．5，表达阶段用3mol/L HCl调节pH在7．5左右，发酵6h后放罐。通常发酵水平在2　000u/mL左右。

（5）重组SOD的纯化。上述发酵液用冷冻离心机离心，弃上清液得到菌体，加入一定量的pH为8．0、0．1mmol/L的Tris－HCl缓冲液和溶菌酶在室温下放置2h后用超声波破碎，4℃下离心去细胞碎片，上清液即为粗酶液。接着上铜螯合亲和柱层析，亲和柱用20mmol磷酸缓冲液平衡，样品上柱后，依次用①20mmol/L磷酸盐缓冲液（pH＝7．2，含0．5mol/L NaCl），②20mmol/L磷酸盐缓冲液（pH＝6．0，含0．5mol/L（NH₄）₂SO₄）洗脱，收集活性峰，透析去盐，浓缩后冷冻干燥得冻干粉，注射重组人SOD的比活约6　000u/mg蛋白，活性回收85%左右。如果进一步用离子交换层析、分子筛等分离纯化，比活可超过10　000u/mg蛋白。

15．3．5．2　重组人Mn－SOD的制备技术

（1）材料。菌株TG1、BL21（DE23）、质粒pBS－ks、质粒pET－24a（＋）为中科院上海生化所吴祥甫教授组保存。

（2）引物设计与合成。

发表的人Mn－SOD cDNA序列，经微机分析，设计2个引物：

引物1为5′……GACATATGAAGCACAGCCTCCCCGACC……3′，含NdeI位点；

引物2为5′……GCAAGCTTGCATAACGATCGTGGTTTAC……3′，含HindIII位点。

总RNA的制备：取约10⁶个人肝细胞（L02），加入1mL的TRIzol试剂，充分匀浆后在室温下放置5min，加入0．2mL的氯仿充分振荡，室温下放置2～3min，4℃下12　000r/min离心15min，上清液加入0．5mL的异丙醇，混匀后室温下放置10min，4℃下12　000r/min离心10min，沉淀以75%的乙醇洗一次后抽干，溶解于50μL经DEAE处理的水中，－20℃下保存。A260/A280为2．5，电泳可清晰见到18S和28S两条核糖体RNA条带，说明我们所抽提的肝组织中的总RNA无明显降解，是完整的。按照cDNA合成试剂盒推荐的方法合成rhMn－SOD cDNA，以此cDNA为模板进行PCR反应，按如下参数循环40次：94℃下变性1min，65℃下退火1min，72℃下延伸1．5min，最后一个循环72℃下延伸10min。分子克隆基本操作技术、PCR、序列测定、SDS－PAGE和蛋白质印迹分析等均可参考有关文献进行。SOD酶活性测定采用连苯三酚自氧化法。蛋白质定量采用福林－酚法。

（3）rhMn－SOD重组子的序列测定。PCR产物经Klenow酶补平后，与EcoRV酶切过的pBS－ks质粒相连接，连接反应中加入10u的EcoRV以预防载体的自身连接，从而大大地提高了重组克隆的筛选率，连接产物转化大肠杆菌TG1，通过NdeI和HindIII双酶切鉴定含有插入片段的重组质粒，随机挑取3个阳性克隆分别进行测序。所测序列与有关文献报道的序列比较，有两处不同，文献中编码第36位天冬酰胺的是AAC，而本处测得的是丝氨酸AGC；文献中编码第131位谷氨酰胺的是CAA，而本处测得的是谷氨酸GAA，其余序列均一致。

（4）rhMn－SOD基因在大肠杆菌中的表达。将克隆在pBS－ks质粒中的rhMn－SOD cDNA以NdeI、HindIII双酶切，低熔点胶分离后与经相同酶切的表达载体pET－22a（＋）相连接，构建表达质粒pET－MnSOD。将此表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），筛选表达菌株BLSOD4。将BLSOD4在37℃LB培养基中（含卡那霉素50mg/L）培育至A600＝0．4～0．6时，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，800μmol/L的Mn^2＋诱导培养5h，收集菌体，并进行SDS－PAGE分析，结果表明，经1mmol/L IPTG诱导后，可见一相对分子质量为22kD的明显表达条带，凝胶自动扫描分析表示，表达量占菌体总蛋白质的50%。

（5）重组人Mn－SOD的工程菌发酵研究。

①工程菌：BL－SOD4。

②培养基：LB培养基。

③10L发酵罐。

④具体发酵工艺：培养基初始pH＝6．5，接种量5%，37℃下培养，5h后加入1mmol/L IPTG或80mg乳糖诱导，同时加入2．4mmol/L的Mn^2＋进行激活，诱导后继续培养8h，在摇床培养的基础上，用10L发酵罐进行发酵培养，采用调pH和中间补料的方法进行发酵，最终rhMn－SOD的酶活可达1　456～2　000u/mL，比活为1　000u/mg蛋白左右。

⑤纯化的技术路线：

采用上述工艺可获电泳纯rhMn－SOD，比活可达7　494u/mg蛋白。

⑥说明。

a）由于含目的产物的初始物料组成复杂，除了目的产物SOD外，还含有大量的细胞代谢物、残留培养基、无机盐等，特别是SOD的类似物，这会给后续的分离纯化带来困难，因此在实际操作中要特别注意这个问题。

b）rhMn－SOD对pH、温度、金属离子、有机溶剂、剪切力、表面张力等十分敏感，容易失活、变性。

c）如果在纯化过程中采用固定化金属亲和层析、制备型HPLC以及亲和膜分离等新技术，rhMn－SOD的纯度可达98%以上，比活9　000u/mg蛋白以上。

15．3．5．3　重组人EC－SOD的制备

（1）重组菌的培养和rhEC－SOD的表达。取甘油保藏重组菌50μL接种于含50μg/mL硫酸卡那霉素的LB培养液中，37℃下摇瓶培养12h后，按1%接种量进行二级培养。培养约2h，600nm处吸收度（A600）大于0．4时，用终浓度为0．5mmol/L的IPTG诱导，1h后开始取样。为保证所取菌体量一致，使取样体积（单位为mL）与吸收度的乘积为1。离心（10　000r/min）10min，向菌体中加入1×SDS凝胶加样缓冲液60μL和巯基乙醇5μL，沸水中煮10min，离心（12　000r/min）10min后，取上清液15μL进行SDS－PAGE蛋白电泳。

（2）rhEC－SOD的表达及诱导时间的影响。诱导后的SDS－PAGE电泳见图15－11，可见在31kD附近有明显的表达。诱导1h后表达量相当低，2h时表达较为明显，3～4h后表达基本稳定。

（3）IPTG浓度的影响。电泳结果表明，IPTG浓度不同，在3h时表达量基本一致。

（4）不同乳糖浓度的影响。电泳结果表明，乳糖浓度不同，在3h时表达量基本一致。由图15－12可见，10mmol/L乳糖与0．2mmol/L IPTG分别诱导3h的蛋白表达量也基本一致。

图15－11　不同诱导剂的表达电泳图谱

M—标准相对分子质量；1—10mmol/L乳糖诱导3h；2—0．2mmol/L IPTG诱导3h

图15－12　不同诱导剂的表达电泳图谱

M—标准相对分子质量；1—空白质粒pET－28a（＋）诱导1h；2—表达质粒EC－pET－28a（＋）诱导1h；3—表达质粒诱导2h；4—表达质粒诱导3h；5—表达质粒诱导4h

（5）细胞培养温度的影响。图15－13显示，随着温度降低表达量也明显降低。20℃下培养所得菌体经超声处理后的上清液中开始出现可溶性蛋白。15℃下培养所得菌体处理后的上清液中表达已很明显。

图15－13　不同培养温度下菌体（A）和超声处理上清液（B）的表达电泳图谱

M—标准相对分子质量；1—30℃；2—25℃；3—20℃；4—15℃

（6）发酵培养及纯化中的关键技术。

①在大肠杆菌系统的基因表达中，诱导剂对基因表达量有十分重要的影响。一般IPTG的诱导效果明显优于乳糖和半乳糖，因此最为常用。但在本工程菌的表达中，IPTG和乳糖对表达量影响的差异并不明显，同种诱导剂不同浓度间诱导效果也相近。因此可用低浓度的廉价乳糖来代替价格昂贵的IPTG进行诱导。

②本基因在表达中产生的是包含体，必须进行蛋白重折叠才能发挥功能。由于该蛋白最终折叠成4个亚基才能发挥作用，且含二硫键较多，因此包含体体外折叠率较低。如果能在超声处理后的上清液中得到可溶性表达则可以避免处理包含体的步骤。低温培养细胞是经常采用的方法，由于在低温下蛋白合成速度降低，表达量也会下降，从而有机会进行较为正确的折叠。由本实验结果来看，虽然低温培养时有可溶性表达，但其后的测活实验中并未测出活性，说明蛋白未能完全正确折叠。

③在工程菌的培养表达中，诱导时机也十分重要。对不同基因而言，因表达量不一，具体诱导时机要通过实验来确定。本研究中选择A600为0．6～1．0时诱导，此时虽然一定量菌体的蛋白表达量没有变化，但菌体密度高，蛋白表达总量也较高。