基因芯片检测技术原理

第五节　生物芯片技术

20世纪90年代初开始实施的人类基因组计划引发了分子生物学技术的一场革命，即生物芯片技术的产生。目前已完成几百种微生物以及高等动植物的全基因组序列，大量的基因序列数据正在以前所未有的几何速度递增。一个现实的科学问题摆到了人们面前：如何认识如此众多基因及碱基序列在生命过程中所担负的功能？如何有效利用如此大量的基因信息揭示人类生老病死的一般规律，并为人类最终战胜各种病魔提供有效武器？从这个意义上说，人类基因图谱只是一部无形的天书，解读这部天书的工作绝不比完成这部天书轻松。只有完成这一步，人类基因组才能够广泛地被人类利用。传统的研究方法是通过分子生物学的手段克隆一个基因，然后用生物化学、遗传学以及生理学的手段研究它的功能。用这样的方法研究一个基因就需要花费大量的人力物力。而对于那些与不止一个基因有关的生命现象，传统的方法就难以满足要求了。因此，新技术的出现成为一种必然。于是，一项类似于计算机芯片技术的新兴生物高技术——生物芯片，随着人类基因组研究的进展应运而生了。

生物芯片是近10年在生命科学领域中迅速发展起来的一项高新技术。它主要是指通过微加工和微电子技术在固体芯片表面构建微型生物化学分析系统，以实现对生命机体的组织、细胞、蛋白质、核酸、糖类以及其他生物组分进行的准确、快速、大信息量的检测。生命科学的发展，尤其是人类基因组计划的实施和完成，使得人类掌握了大量的基因。但是如何研究和利用这些基因是摆在人类面前的一项更加艰巨的任务。

一、生物芯片的概念

生物芯片是指采用光导原位合成或微量点样等方法，将大量生物大分子如核酸片段、多肽分子甚至组织切片、细胞等生物样品有序地固化于支持物（如玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝胶、尼龙膜等载体）的表面，组成密集二维分子排列，然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交，通过特定的仪器如激光共聚焦扫描或电荷偶联摄影像机（CCD）对杂交信号的强度进行快速、并行、高效的检测分析，从而判断样品中靶分子的数量。由于常用玻片／硅片作为固相支持物，且在制备过程模拟计算机芯片的制备技术，所以称之为生物芯片技术。根据芯片上的固定的探针不同，生物芯片包括基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片、组织芯片，另外根据原理还有元件型微阵列芯片、通道型微阵列芯片、生物传感芯片等新型生物芯片。如果芯片上固定的是肽或蛋白，则称为肽芯片或蛋白芯片；如果芯片上固定的分子是寡核苷酸探针或DNA，就是DNA芯片。由于基因芯片这一专有名词已经被业界的领头羊Affymetrix公司注册专利，因而其他厂家的同类产品通常称为DNA微阵列。这类产品是目前最重要的一种，有寡核苷酸芯片、cDNA芯片和Genomic芯片之分，包括两种模式：一是将靶DNA固定于支持物上，适合于大量不同靶DNA的分析，二是将大量探针分子固定于支持物上，适合于对同一靶DNA进行不同探针序列的分析。

生物芯片技术是20世纪90年代中期以来影响最深远的重大科技进展之一，是融微电子学、生物学、物理学、化学、计算机科学为一体的高度交叉的新技术，具有重大的基础研究价值，又具有明显的产业化前景。由于用该技术可以将极其大量的探针同时固定于支持物上，所以一次可以对大量的生物分子进行检测分析，从而解决了传统核酸印迹杂交技术复杂、自动化程度低、检测目的分子数量少、低通量等的不足。而且，通过设计不同的探针阵列、使用特定的分析方法可使该技术具有多种不同的应用价值，如基因表达谱测定、突变检测、多态性分析、基因组文库作图及杂交测序（SBH）等，为“后基因组计划”时期基因功能的研究及现代医学科学及医学诊断学的发展提供了强有力的工具，将会使新基因的发现、基因诊断、药物筛选、给药个性化等方面取得重大突破，为整个人类社会带来深刻广泛的变革。该技术被评为1998年度世界十大科技进展之一。

DNA芯片也被称为基因芯片、DNA阵列、寡聚核苷酸微芯片，甚至通常所说的生物芯片也就是指DNA芯片。DNA芯片以DNA的碱基配对、序列互补原理为基础分辨单个核苷酸，以实现对核酸序列的分析。核酸上的碱基共有四种，分别记为A、T、C、G，两条DNA链的结合通过A与T、C与G的严格配对来实现。DNA芯片利用微缩技术在1cm²左右的基质材料（如尼龙膜、玻璃片、硅胶晶片、微缩磁珠等）上将成千上万个甚至上百万的核酸或核酸片段按照一定顺序排列成密集的分子阵列。检测时，把含有经过标记的目标DNA分子的溶液滴到芯片上，组成目标DNA的四种碱基就在芯片上自动寻找相配对的碱基序列。通过检测标记信号可以得到分子杂交的情况，并由计算机分析处理，最终可以知道样品中所含有的各种核酸。

二、DNA芯片的制备技术基本过程

DNA芯片的开发应用是一个较为复杂的过程。首先，要根据所要检测的目标进行芯片设计。也就是根据要检测的信息，利用生物信息学的方法确定所要检测的目标序列。通常可以从分子生物学信息数据库如EMBL和Gene Bank中查询到所需的DNA序列。一般而言并不需要整个基因序列，而只要该基因中高度特异的一段就可以了。这段序列是别的基因所没有的，只要检测到了这段序列就说明存在着这个基因。根据这段目标序列设计出一段能够与之配对结合的序列，我们称之为寡聚核苷酸探针，然后将这些探针按照一定的规则排列在芯片上，就形成了探针阵列。然后将各个探针的序列和在芯片上的位置存放到数据库中，用以进行检测到的信号的分析。

1．DNA方阵的构建　选择硅片、玻璃片、瓷片或聚丙烯膜、尼龙膜等支持物，并作相应处理，然后采用光导化学合成和照相平版印刷技术可在硅片等表面合成寡核苷酸探针；或者通过液相化学合成寡核苷酸链探针，或PCR技术扩增基因序列，再纯化、定量分析，由阵列复制器，或阵列机及电脑控制的机器人，准确、快速地将不同探针样品定量点样于带正电荷的尼龙膜或硅片等相应位置上，再由紫外线交联固定后即得到DNA微阵列或芯片。

2．样品DNA或mRNA的准备　从血液或活组织中获取的DNA／mRNA样品在标记成为探针以前必须进行扩增提高阅读灵敏度。Mosaic Technologies公司发展了一种固相PCR系统，好于传统PCR技术，他们在靶DNA上设计一对双向引物，将其排列在丙烯酰胺薄膜上，这种方法无交叉污染且省去液相处理的繁琐；Lynx Therapeutics公司提出另一个革新的方法，即大规模平行固相克隆，这个方法可以对一个样品中数以万计的DNA片段同时进行克隆，且不必分离和单独处理每个克隆，使样品扩增更为有效快速。

在PCR扩增过程中，必须同时进行样品标记，标记方法有荧光标记法、生物素标记法、同位素标记法等。

3．分子杂交　样品DNA与探针DNA互补杂交要根据探针的类型和长度以及芯片的应用来选择、优化杂交条件。如用于基因表达监测，杂交的严格性较低，低温、时间长、盐浓度高；若用于突变检测，则杂交条件相反。芯片分子杂交的特点是探针固化，样品荧光标记，一次可以对大量生物样品进行检测分析，杂交过程只要30min。美国Nangon公司采用控制电场的方式，使分子杂交速度缩到1min，甚至几秒钟。德国癌症研究院的Jorg Hoheisel等认为以肽核酸（PNA）为探针效果更好。

4．杂交图谱的检测和分析　用激光激发芯片上的样品发射荧光，严格配对的杂交分子，其热力学稳定性较高，荧光强；不完全杂交的双键分子热力学稳定性低，荧光信号弱（为前者的1／35～1／5），不杂交的无荧光。不同位点信号被激光共焦显微镜，或落射荧光显微镜等检测到，由计算机软件处理分析，得到有关基因图谱。目前，如质谱法、化学发光法、光导纤维法等更灵敏、快速，有取代荧光法的趋势。

三、应用领域

1.基因表达水平的检测　用基因芯片进行的表达水平检测可自动、快速地检测出成千上万个基因的表达情况。Schena等采用拟南芥基因组内共45个基因的cDNA微阵列（其中14个为完全序列，31个为EST），检测该植物的根、叶组织内这些基因的表达水平，用不同颜色的荧光素标记逆转录产物后分别与该微阵列杂交，经激光共聚焦显微扫描，发现该植物根和叶组织中存在26个基因的表达差异，而参与叶绿素合成的CAB1基因在叶组织较根组织表达高500倍。Schena等用人外周血淋巴细胞的cDNA文库构建一个代表1046个基因的cDNA微阵列，来检测体外培养的T细胞对热休克反应后不同基因表达的差异，发现有5个基因在处理后存在非常明显的高表达，11个基因中度表达增加和6个基因表达明显抑制。该结果还用荧光素交换标记对照和处理组及RNA印迹方法证实。在HGP完成之后，用于检测在不同生理、病理条件下的人类所有基因表达变化的基因组芯片为期不远了。

2.基因诊断　从正常人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就可以得出标准图谱。从病人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就可以得出病变图谱。通过比较、分析这两种图谱，就可以得出病变的DNA信息。这种基因芯片诊断技术以其快速、高效、敏感、经济、平行化、自动化等特点，将成为一项现代化诊断新技术。如Affymetrix公司，把P53基因全长序列和已知突变的探针集成在芯片上，制成P53基因芯片，将在癌症早期诊断中发挥作用。又如，Heller等构建了96个基因的cDNA微阵，用于检测分析风湿性关节炎（RA）相关的基因，以探讨DNA芯片在感染性疾病诊断方面的应用。现在，肝炎病毒检测诊断芯片、结核杆菌耐药性检测芯片、多种恶性肿瘤相关病毒基因芯片等一系列诊断芯片逐步开始进入市场。基因诊断是基因芯片中最具有商业化价值的应用。

3．药物筛选　如何分离和鉴定药的有效成分是目前中药产业和传统的西药开发遇到的重大障碍，基因芯片技术是解决这一障碍的有效手段，它能够大规模的筛选，通用性强，能够从基因水平解释药物的作用机理，即可以利用基因芯片分析用药前后机体的不同组织、器官基因表达的差异。如果在cDNA表达文库得到的肽库制作肽芯片，则可以从众多的药物成分中筛选到起作用的部分物质。还有，利用RNA、单链DNA有很大的柔性，能形成复杂的空间结构，更有利于与靶分子相结合的特点，可将核酸库中的RNA或单链DNA固定在芯片上，然后与靶蛋白孵育，形成蛋白质—RNA或蛋白质—DNA复合物，可以筛选特异的药物蛋白或核酸，因此芯片技术和RNA库的结合在药物筛选中将得到广泛应用。在寻找HIV药物中，Jellis等用组合化学合成及DNA芯片技术筛选了654536种硫代磷酸八聚核苷酸，并从中确定了具有XXG4XX样结构的抑制物，实验表明，这种筛选物对HIV感染细胞有明显阻断作用。生物芯片技术使得药物筛选、靶基因鉴别和新药测试的速度大大提高，成本大大降低。基因芯片药物筛选技术工作目前刚刚起步，美国很多制药公司已开始前期工作，即正在建立表达谱数据库，从而为药物筛选提供各种靶基因及分析手段。这一技术具有很大的潜在应用价值。

4．个体化医疗　临床上，同样药物的剂量对病人甲有效可能对病人乙不起作用，而对病人丙则可能有副作用。在药物疗效与副作用方面，病人的反应差异很大。这主要是由于病人遗传学上存在差异（单核苷酸多态性，SNP），导致对药物产生不同的反应。如细胞色素P450酶与大约25%广泛使用的药物的代谢有关，如果病人该酶的基因发生突变就会对降压药异喹胍产生明显的副作用，5%～10%的高加索人缺乏该酶基因的活性。现已弄清楚这类基因存在广泛变异，这些变异除对药物产生不同反应外，还与易犯各种疾病如肿瘤、自身免疫病和帕金森病有关。如果利用基因芯片技术对患者先进行诊断，再开处方，就可对病人实施个体优化治疗。另一方面，在治疗中，很多同种疾病的具体病因是因人而异的，用药也应因人而异。如乙肝有较多亚型，HBV基因的多个位点如S、P及C基因区易发生变异。若用乙肝病毒基因多态性检测芯片每隔一段时间就检测一次，这对指导用药防止乙肝病毒耐药性很有意义。又如，现用于治疗AIDS的药物主要是病毒逆转录酶RT和蛋白酶PRO的抑制剂，但在用药3～12月后常出现耐药，其原因是rt、pro基因产生一个或多个点突变。Rt基因四个常见突变位点是Asp67→Asn、Lys70→Arg、Thr215→Phe、Tyr和Lys219→Glu，四个位点均突变较单一位点突变后对药物的耐受能力成百倍增加。如将这些基因突变部位的全部序列构建为DNA芯片，则可快速地检测病人是这一个或那一个或多个基因发生突变，从而可对症下药，所以对指导治疗和预后有很大的意义。

5．测序及病原微生物的鉴定　基因芯片利用固定探针与样品进行分子杂交产生的杂交图谱而排列出待测样品的序列，这种测定方法快速而具有十分诱人的前景。Mark chee等用含135000个寡核苷酸探针的阵列测定了全长为16．6kb的人线粒体基因组序列，准确率达99%。Hacia等用含有48000个寡核苷酸的高密度微阵列分析了黑猩猩和人BRCA1基因序列差异，结果发现在外显子11约3．4kb长度范围内的核酸序列同源性在98．2%到83．5%之间，提示了二者在进化上的高度相似性。据未经证实的报道，去年有一种不成熟的生物芯片在15min内完成了1．6万个碱基对的测定，96个这样的生物芯片的平行工作，就相当于每天1．47亿个碱基对的分析能力。在微生物的鉴定方面，现已开发出炭疽、鼠疫、流行性出血热等疾病的抗体及抗原蛋白芯片，特别是在鉴定新发传染病方面。

研究证实，果蝇染色体DNA的长度是大肠杆菌DNA的25倍，人类染色体DNA的长度是大肠杆菌DNA的600倍。真核细胞DNA中基因密度明显低于原核和病毒。如人体细胞DNA平均每毫米只带有50个基因，而大肠杆菌DNA中基因密度每毫米DNA带有2400个基因！人体一个细胞中DNA的长度约有2m，而一个细菌DNA的长度只有1.7mm。一个成年人体内约含有1×10¹⁴个细胞，那么一个成人体内全部DNA的总长度为2×10¹¹km。原核细胞生物基因组多体现出单细胞“单兵作战”的特点，而真核细胞基因组体现出细胞间“协同作战”的特点。

6．生物信息学研究　人类基因组计划（HGP）是人类为了认识自己而进行的一项伟大而影响深远的研究计划。目前的问题是面对大量的基因或基因片断序列如何研究其功能，只有知道其功能才能真正体现HGP计划的价值——破译人类基因这部天书。后基因组计划、蛋白组计划、疾病基因组计划等概念就是为实现这一目标而提出的。基因的功能并不是独立的，一个基因表达的上调或者下调往往会影响上游和下游几个基因表达状态的改变，从而进一步引起和这几个基因相关的更多基因的表达模式的改变。基因之间的这种复杂的相互作用组成了一张交错复杂的立体的关系网。像过去那样孤立地理解某个基因的功能已经远远不够了，需要我们站在更高的层次全面地理解这种相互关系，全面了解不同个体基因变异、不同组织、不同时间、不同生命状态等的基因表达差异信息，并找出其中规律。生物信息学将在其中扮演至关重要的角色。基因芯片技术就是为实现这一环节而建立的，使对个体生物信息进行高速、并行采集和分析成为可能，必将成为未来生物信息学研究中的一个重要信息采集和处理平台，成为基因组信息学研究的主要技术支撑。比如研究基因生物学功能的最好方式是监测基因在不同组织、不同发育阶段、不同健康状况下在机体中活性的变化。这是一项非常麻烦的工作，但基因芯片技术可以允许研究人员同时测定成千上万个基因的作用方式，几周内获得的信息用其他方法需要几年才能得到。

蛋白芯片与基因芯片的原理相似。不同之处有，一是芯片上固定的分子是蛋白质，如抗原或抗体等。其二，检测的原理是依据蛋白分子、蛋白与核酸、蛋白与其他分子的相互作用。蛋白芯片技术出现得较晚，尚处于发展时期，最近也取得了重大进展。如最近一期《科学》杂志报道了酵母蛋白质组芯片。这是目前为止第一个包含一种生物全部蛋白质分子的蛋白质芯片。相信，不久将会有包含更高等生物甚至人类蛋白质组的蛋白质芯片研制成功，并应用于生物医学基础研究和疾病诊断。芯片实验室是生物芯片技术发展的最终目标。它将样品制备、生化反应以及检测分析的整个过程集约化形成微型分析系统。现在已有由加热器、微泵、微阀、微流量控制器、微电极、电子化学和电子发光探测器等组成的芯片实验室问世，并出现了将生化反应、样品制备、检测和分析等部分集成的生物芯片。

美国科学促进会将基因芯片技术列为1998年度自然科学领域十大进展之一，足见其在科学史上的意义。现在，基因芯片这一时代的宠儿已被应用到生物科学众多的领域之中。它以其可同时、快速、准确地分析数以千计基因组信息的本领而显示出了巨大的威力。目前在文献上可查到的生物芯片的应用有基因表达谱、HLA分型、SNP分析、丙型肝炎分型、物种鉴定、DNA测序、连锁不平衡作图、HIV－1诊断、BRCA1突变分析、炎症分析、线粒体基因组分析、囊性纤维检测、地中海贫血症突变检测、寡核苷酸间相互作用研究，等等。在基因表达检测的研究上人们已比较成功地对多种生物包括拟南芥、酵母及人的基因组表达情况进行了研究，并且用该技术（共157112个探针分子）一次性检测了酵母几种不同株间数千个基因表达谱的差异。实践证明基因芯片技术也可用于核酸突变的检测及基因组多态性的分析，如对人BRCAⅠ基因外显子11、CFTR基因、β－地中海贫血、酵母突变菌株间、HIV－1逆转录酶及蛋白酶基因（与Sanger测序结果一致性达到98%）等的突变检测，对人类基因组单核苷酸多态性的鉴定、作图和分型，人线粒体16．6kb基因组多态性的研究等。将生物传感器与芯片技术相结合，通过改变探针阵列区域的电场强度已经证明可以检测到基因（ras等）的单碱基突变。此外，有人还曾通过确定重叠克隆的次序从而对酵母基因组进行作图。由最新报道可以发现运用生物芯片分析SNP的研究开展得如火如荼，一方面可以用芯片大规模筛选新的SNP，更重要的是药物遗传SNP的研究有助于新药的开发，还可以针对不同基因型的个体采取不同的治疗方法和用药，以获得最佳疗效。

广义的生物芯片是指任何能对生物分子进行快速并行处理和分析的微型固体薄型器件。目前开发的生物芯片包括基因芯片（寡核苷酸芯片和DNA芯片）、蛋白质芯片、组织芯片、细胞芯片和糖芯片等，是近10年在生命科学领域中迅速发展起来的一项高新技术。在实际应用方面，生物芯片技术可广泛应用于疾病诊断和治疗、药物基因组图谱、药物筛选、中药物种鉴定、农作物的优育优选、司法鉴定、食品卫生监督、环境监测、国防等许多领域。它将为人类认识生命的起源、遗传、发育与进化、为人类疾病的诊断、治疗和防治开辟全新的途径，为生物大分子的全新设计和药物开发中先导化合物的快速筛选和药物基因组学研究提供技术支撑平台。相信不久，病原微生物的生物芯片将会被应用于各种疾病的诊断和治疗中。总之，生物芯片技术将会在医学、生命科学、药业、农业、环境科学等凡与生命活动有关的领域中具有重大的应用前景。

相信不久鼠疫菌的全基因及抗原、抗体芯片技术将应用于鼠疫的病原学诊断中，特别是对疑似病例的快速诊断。