基因转导技术

哺乳动物导入基因获得表达是个非常有用的方法，通过表达一些细胞因子或其他功能基因，可研究该基因的功能及调控，还可用于基因治疗。

一、目的基因的获取

要克隆某一基因并将其导入培养细胞，首先必须分离并制备目的基因。目前获取目的基因的方法主要有通过基因组文库或cDNA文库分离筛选基因、人工合成基因及应用聚合酶链式反应（polymerase　chain　reaction，PCR）获取目的基因。PCR技术将在第3章介绍，其他方法请参考分子克隆或基因工程有关专业书籍。

二、目的基因与载体的连接

利用DNA连接酶把目的基因片段和载体DNA连接在一起，成为一个新的重组分子，这就是DNA的体外连接。目的DNA片段被限制性酶消化后其末端只可能有3种形式：带有相同的黏性末端、带有非互补的黏端、带有平末端。下面介绍他们与载体之间的两种连接方式。

【实验用品】

1．器材　移液器、Tip头、Eppendof管、恒温水浴箱。

2．试剂与材料　见操作步骤。

【操作步骤】

1．黏性末端连接　为防止载体DNA自身环化，在连接前需除去载体分子5′端磷酸，使之最大程度抑制载体环化现象。

（1）建立下列去磷酸基团的反应体系：线性化载体（已酶切）10μl、10×小牛肠碱性磷酸酶（calf　intestinal　alkaline　phosphatase，CIP）缓冲液2μl（与酶配套）、CIP0．5μl、双蒸水7．5μl。37℃水浴15min。再加入CIP0．5μl，置55℃水浴45min。

（2）加入2μl　0．5mol／L　EDTA，65℃灭活15min。乙醇沉淀，TE（10mmol／L　pH8．0 Tris－HCl、1mmol／L　pH8．0EDTA）溶解。

（3）0．5ml　Ep管中建立连接反应体系：线性化目的基因（0．4μg）4μl、载体DNA（经上述CIP处理）1μl、10×连接酶缓冲液1μl（与酶配套）、T4DNA连接酶1μl、加双蒸水至10μl。16℃水浴12～16h。

2．平－黏端连接

（1）制备目的基因酶切片段（如二端均为EcoRⅠ黏端）。

（2）制备载体酶切片段（一端为EcoRⅠ黏端，一端为其他酶切的黏端）。

（3）用T4连接酶连接匹配的黏末端（见黏性末端连接（3），另一端不匹配，无法连接）。

（4）用Klenow补平不匹配的黏末端：目的DNA和（或）线性载体0．5μg、10×大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段1μl、2mmol／L　dNTP　2μl、加双蒸水至20μl。37℃水浴1h。

（5）乙醇沉淀，溶于7μl　TE（10mmol／L pH8．0Tris－HCl、1mmol／L　pH8．0EDTA）。

（6）取上述5μlTE，加1μl连接缓冲液、1μl连接酶、双蒸水13μl作用16～20h。

（7）电泳观察连接效果（2μl　TE来自（5），作为连接前对照）并估计含量。

（8）取适量作转化。

【注意事项】　反应体系的微升数仅供参考，关键要定出目的基因和载体DNA的量，并要考虑最低消耗量，如电泳观察连接效果所需量。

三、外源基因的导入方法

基因导入细胞的方法主要有四种：磷酸钙共转染法、DEAE－葡聚糖介导转染法、脂质体介导转染法及电穿孔法。其中，脂质体介导转染法转染效率较高，使用简便，目前被多数实验室所采用，这里对该法做一介绍。

现已有很多厂家可提供脂质体转染试剂，其原理是：细胞膜表面是负电荷，脂质颗粒带正电荷，可通过电荷间的引力将DNA、mRNA或单股RNA导入细胞内。

【实验用品】

1．器材　超净工作台、CO2培养箱、移液器、培养皿、试管、离心机。

2．试剂　培养基、血清、抗生素、脂质体转染试剂如Gibico　BRL公司的Lipofectamine。

3．材料　质粒DNA、培养的细胞。

【操作步骤】

1．贴壁细胞转染方法

（1）收获细胞：将1×105～2×105细胞重悬于2ml完全培养基中，接种于35mm培养皿中。37℃，5%CO2培养箱中培养18～24 h，使细胞达到50%～80%融合。

（2）在12mm×75mm无菌玻璃试管中制备下列溶液：溶液A（将2～20μg质粒DNA溶于100μl无血清培养中）、溶液B（20μl　Lipofectamine稀释于80μl无血清培养基中）。

（3）合并溶液A和溶液B，轻轻混合。置于室温15min。

（4）弃去细胞培养液，并用无血清培养基洗涤细胞1次。

（5）加0．8ml无血清培养基至Lipofectamine－DNA混合物中，混匀后，小心滴加至细胞上，轻轻混匀。37℃，5%CO2培养箱中培养5～24h。

（6）弃去转染液，加2ml完全培养基，继续培养。

（7）转染后48～72h，测定细胞的瞬时表达情况，如用于稳定表达，可于转染48h后更换选择培养基如G418进行筛选。

2．悬浮细胞瞬时转染方法

（1）收获细胞，用无血清培养基洗涤细胞1次。将2×106～3×106细胞重悬于0．8ml无血清培养基中，转种于35mm培养皿中。

（2）参照贴壁细胞转染方法制备Lipofectamine－DNA混合物，将制备的Lipofectamine－DNA混合物加至细胞悬液中，轻轻混匀，5%CO2培养箱中培养5～24h。

（3）加4ml完全培养基继续培养。

（4）转染后48～72h，800g离心5min收集细胞，检测细胞瞬时表达情况。