组织工程软骨检测技术

组织工程软骨检测技术_组织工程学实验技

各类软骨组织因在体内存在部位不同，功能上也有较大差异。组织工程技术再生软骨或缺损区修复软骨，能否真正达到正常软骨组织的形态并具备相应功能，必须通过全面的检测与评价，并与相应的正常软骨进行系统地比较才能得出较为客观的结论。总体上讲，对组织工程技术再生软骨的检测与评价指标至少应包括大体观察、组织学检查、生物力学检测及软骨特异性基质含量的定量半定量检测等几个方面。按标本取材后的处理顺序，相关检测的具体操作步骤如下。

一、大 体 观 察

不同部位再生软骨的观察内容与侧重点略有不同。对于软骨缺损修复结果的观察，取材时应将整个修复组织连同部分正常组织一并取材，以便对修复界面进行观察。对于关节缺损修复的观察还应包括软骨下松质骨修复的观察。可以用电锯将整个缺损修复区连同周围部分正常软骨及松质骨一起锯下，然后从缺损中央锯开，以便观察缺损内部修复情况。

1．皮下构建软骨大体观察　新生软骨表面的观察主要从色泽、质地、光滑程度、连续性及其与正常软骨的相近程度几个方面进行比较和观察。剖面重点观察新生软骨的均质程度，有无中空现象，有无纤维性组织掺杂等。此外，对于皮下构建的软骨可以通过测定新生软骨的体积（排水法）和湿重对新生软骨进行初步的定量评价。

2．关节软骨缺损修复大体观察　缺损修复表面主要观察软骨缺损修复面积，新生软骨表面的色泽、光滑程度及其与周围正常关节软骨的连续性，有无明显的凹陷或断裂，有无明显的软骨下松质骨外露等。剖面主要观察新生软骨、骨与正常的软骨、骨之间是否有明显的界面，修复软骨厚度，修复部分有否明显的凹陷与空洞，有无软组织掺杂，软骨与松质骨交界面与正常有无差异。

3．半月板软骨缺损修复大体观察　缺损修复表面主要观察软骨缺损修复范围，新生软骨表面的色泽、光滑程度及其与周围正常半月板软骨组织的连续性，半月板大体形态是否正常，有无明显的凹陷或断裂，与周围正常组织有无明显粘连等。剖面主要观察新生半月板软骨与正常组织有无明显的界面，修复有无明显的凹陷与空洞，有无软组织掺杂等。

二、生物力学（抗压弹性模量）测定

主要用于评价组织工程技术构建软骨的力学特性，推断其是否具备体内正常软骨所行使的支撑、保护、分散应力、减小振荡等相应功能。大致方法如下：

将皮下构建的软骨或软骨缺损（关节或半月板缺损）修复区全部新生软骨组织修剪成直径6mm的圆形软骨片，转移到相应直径大小的压力测定标本槽内，加入少许PBS，输入软骨片相应的厚度，以最大负荷450N的压力，1mm／min的位移速度加压，根据软骨的厚度、力－时间－位移曲线，生物力学分析仪（INSTRON　5542型）可自动将所得弹性模量（Young’s　modulus）的平均值列出。反复测定3～5次，比较其与相应正常软骨组织的差异。

三、蛋白多糖（GAG）含量测定

GAG是软骨组织相对特异性的细胞外基质，它的含量是否正常对于维持软骨功能非常重要。因此，测定新生软骨中的GAG含量是检测与评价组织工程化软骨成熟程度及是否功能正常的一项重要指标。测定GAG含量最常用的方法是阿利辛蓝法，其大致方法及具体步骤如下：

1．配制裂解液　50mmol／L　Tris．Cl（pH＝8．0）、150mmol／L　NaCl、100mg／L苯基甲基磺酰氯（PMSF）、1mg／L抑蛋白酶肽（aprotinin）、1%吐温－20、0．5%去氧胆酸钠、0．1%十二烷基硫酸钠（SDS）。

2．配制阿利辛蓝储液　5g阿利辛蓝溶于100ml　0．018mol／L　H2SO40．4mol／L GnCl。

3．配制溶液1　0．054mol／L　H2SO4 0．75%Triton　X－100。

4．配制溶液2　5ml　阿利辛蓝储液中加入1．0ml　1．8mol／L　H2SO4、8．0ml　8mol／L GnCl、2．5ml　10%Triton　X－100，最后加ddH2O定溶至100ml。

5．标本处理　取50mg待测软骨组织，加入适量裂解液（约200μl）研磨形成糜状，－60℃冻干，冻干产物以1ml　PBS溶解。

6．GAG含量测定过程

（1）50μl标本溶液与50μl　8mol／L　GnCl混匀，静置15min。

（2）依次加入50μl溶液1、750μl溶液2，振荡混匀，4℃反应1h。12　000r／min离心15min，弃上清。

（3）750μl二甲基亚砜（DMSO）洗液（40%DMSO－0．05mol／L　MgCl2）室温下振洗30min，12　000r／min离心15min，弃上清。

（4）加入100μl溶解液（4．0mol／L GnCl－33%异丙醇）重新溶解阿利辛蓝－蛋白聚糖沉淀复合物，吹打均匀。

（5）溶解后的液体转移入96孔板中，酶标仪600nm波长处测定吸光度值。将ddH2O和裂解液同样处理，分别作为空白对照及阴性对照。

（6）将硫酸软骨素（CS）梯度稀释至1、2、10、20、30、40g／L，按上述处理标本溶液同样方法测定其吸光度值，绘制硫酸软骨素（CS）浓度－吸光度值标准曲线。

（7）根据标准曲线及标本的吸光度值测算出标本中蛋白聚糖的实际含量。

四、组织学检查

组织学检查是评价组织工程化软骨与正常软骨相似程度的最重要指标之一，它可以较为明确地判断组织工程化软骨的成熟程度、均质程度及其与周围正常组织的界面愈合与连续性等。组织学观察的内容与侧重点与大体观察基本一致，只是从宏观结构观察转变为微观结构的观察。组织学检查的操作过程主要包括标本的固定、包埋（关节组织须先经脱钙等处理）、切片及各种染色处理，软骨组织学检查的基本操作过程与其他组织大致相同，这里仅介绍几种软骨检测与鉴定中常用的染色方法及相应观察内容。

（一）HE染色

主要观察新生组织的一般组织学形态，包括新生软骨的成熟度、细胞密度，有无成熟软骨陷窝结构（纤维软骨无明显陷窝结构），有无纤维性组织掺杂，有无新生血管，对于软骨缺损修复结果，除上述一般组织形态观察外，应注意观察修复软骨与正常软骨交界处是否连续，修复软骨厚度与周围正常软骨有无差异，缺损修复区内有无组织断裂。关节缺损修复还应观察新生软骨与松质骨之间有无骺板样组织形成，缺损区骨组织内有无纤维化，有无成熟的骨小梁与骨陷窝等。HE染色的主要操作步骤如下。

1．石蜡切片置于二甲苯Ⅰ、Ⅱ内脱蜡2次，5～10min／次。

2．无水乙醇Ⅰ、Ⅱ各2min，依次经过95%、85%、75%乙醇各3min复水。

3．自来水彻底冲洗，蒸馏水洗2次。

4．苏木精染液染细胞核5～15min，自来水冲洗，1%盐酸乙醇（70%）分化数秒；流水冲洗10～30min。蒸馏水冲洗。

5．伊红染液染色1～2min。

6．经95%、100%乙醇依次脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

7．染色结果，细胞核呈深蓝色，软骨基质染成蓝色至深蓝色，骨小梁呈红色。弹性软骨及透明软骨陷窝结构清晰可见，呈空泡样，不着色。

（二）麦松三色（Masson　Trichrome）染色

主要用以显示或区分各种纤维成分，观察新生软骨组织内的胶原沉积、分布及排列方式。上述HE染色相应观察内容也同样适用于麦松三色染色。具体染色方法大致如下。

1．试剂配制

（1）Regaud苏木精染液：苏木精1g、95%乙醇10ml，甘油10ml，蒸馏水80ml。

（2）丽春红酸性复红橘黄G液：丽春红0．7g、酸性复红0．3g，橘黄G　2g，蒸馏水99ml，冰醋酸1ml。

（3）亮绿染液：亮绿2g，冰醋酸2ml，蒸馏水98ml。

（4）磷钨酸溶液：磷钨酸5g，蒸馏水100ml。

（5）醋酸液：冰醋酸1ml，蒸馏水99ml。

（6）天青－A液：天青－A　1g，蒸馏水100ml。

2．染色程序

（1）切片脱蜡至水，天青－A 液染色5min。

（2）Regaud苏木精液染色5min，1%盐酸乙醇分化数秒，入自来水返蓝。

（3）丽春红酸性复红橘黄G液1份、1%醋酸液9份，染色5min。

（4）不经水洗，5%磷钨酸液分化10min。

（5）亮绿染液染色20～30min。

（6）迅速用无水乙醇清洗，二甲苯透明，中性树胶封固。

3．染色结果　胶原纤维呈绿色，其他软骨基质呈红色，细胞核呈蓝黑色。

（三）Ⅱ型胶原免疫组化染色

主要用于软骨特异性细胞外基质Ⅱ型胶原表达的鉴定，是确定软骨组织特异性的最重要指标之一。具体方法如下。

1．石蜡切片常规脱蜡至水；PBS漂洗3次，3min／次；加3%过氧化氢溶液，置湿盒内37℃孵育30min。

2．0．4%胃蛋白酶（0．1mol／L盐酸配制）37℃湿盒内消化30min，充分暴露抗原位点，PBS漂洗3次，3min／次。

3．滴加10%正常灭活羊血清（用10%牛血清清蛋白液稀释），置湿盒内37℃孵育30min，弃去液体，直接滴加第一抗体（第一抗体用0．5%牛血清清蛋白1∶100～200稀释），置湿盒内37℃孵育1～2h或4℃冰箱内过夜（14～18h）。

4．PBS漂洗3次，3min／次　滴加多聚物酶标记的第二抗体；PBS漂洗3次，3min／次。

5．3，3－二氨基联苯胺（DAB）显色液（由DAB稀释液将DAB原液稀释50倍配制，应新鲜配制）显色10～20min（镜下控制显色时间）。

6．显色后组织切片置流水中终止反应；细胞核衬染（苏木精染色至细胞核呈蓝色）；常规脱水封片，在光学显微镜下观察染色结果。

7．染色结果，软骨基质呈棕黄色显色反应，主要分布于软骨陷窝周围及细胞间质内。

（四）甲苯胺蓝染色

主要用于软骨特异性细胞外基质蛋白聚糖的染色，也是确定软骨组织特异性的重要指标之一。具体方法如下。

1．甲苯胺蓝染液配制　甲苯胺蓝1．0g，研磨至无明显颗粒，溶于100ml　70%乙醇，定性滤纸过滤备用。

2．染色程序　①切片脱蜡至水，甲苯胺蓝染液染色20～30min；②蒸馏水冲洗至出现紫色异染反应；③无水乙醇快速脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。

3．染色结果　软骨基质呈深紫色（异染现象）至深蓝色，纤维组织基本不着色，骨组织呈浅蓝色。

五、组织工程化软骨检测

技术实验要点

1．上面介绍的几种方法是适用于各类软骨组织检测的较为通用的方法。不同类型软骨在体内存在部位不同，功能及组成各异，又有其各自特殊的评价方法。如弹性软骨中含有较多的弹力纤维，可以通过弹力纤维染色（铁碘苏木精－三氯化铁染色）清楚地显示出来；半月板纤维软骨中Ⅰ型胶原也是其主要的胶原成分之一，可以通过免疫组化染色或偏光显微镜清楚地显示出其表达及排列方式；而对于关节透明软骨，Ⅹ型胶原表达则是其肥大软骨细胞的重要特征。

2．组织工程技术再生的软骨或修复的软骨缺损，能否真正达到正常软骨组织的形态并具备相应功能，必须通过多方面的检测与评价才能得出较为客观的结论。上述各种检测方法均必须以正常软骨作为阳性对照，以此判断组织工程化软骨与正常软骨在形态及功能等方面的相似程度，只有这样才能发现组织工程技术构建软骨的不足之处，以便有的放矢地进行改进和完善，最终实现软骨形态与功能的完全再生。

（上海第二医科大学第九人民医院刘　伟　周广东）