组织工程血管的构建

组织工程血管的构建_组织工程学实验技

一、国内外研究现状的回顾

随着人类文明的进步，营养状况的不断改善，动脉栓塞性疾病威胁到越来越多人的生命，在美国已经成为头号杀手；各种机械损伤、交通伤、枪伤也同时造成大量的血管损伤。同时血管损伤的致残率、死亡率均较高，往往造成肢体的截除甚至患者的死亡。

人们长期以来一直致力于寻找一种血管的最佳替代物。

（一）自体移植

1．自体动脉（如乳内动脉IMA，末梢游离动脉）被认为是迄今为止最理想的替代物，但其来源非常有限且供区牺牲较大，而限制了它的临床应用。

2．自体隐静脉移植是最早应用的血管移植物，但自体静脉存在着来源有限，远期因为长期处于搏动、压力相对较高的环境下，内膜纤维性增生而导致狭窄、闭塞及进行性动脉粥样硬化的发生。

（二）异体静脉移植

采用异体静脉作为血管移植物的想法及方法由来已久，现在用戊二醛处理的人脐静脉已作为商品出售，近年来还有人采用多聚环氧化合物作为交联剂，以改善用戊二醛处理后的组织硬度大，易钙化，本身有致敏性、细胞毒性等不良反应。但异体血管由于自身退行性变、受到宿主的免疫排斥反应以及术后狭窄、动脉瘤形成等不良反应影响移植效果而限制了它的应用。

（三）人工材料

随着化学合成技术的不断进步，人们将注意力转向人工材料的血管替代物上，20世纪50年代问世的聚酯纤维（Dacron）是最早应用的人工血管，由于它对凝血系统激活作用而只能对大口径血管有较短的替代作用。以后又开发利用聚四氟乙烯（polytetrafluoroethylene，PTFE）、聚氯乙烯（polyvinyl chloride，PVC），聚乙烯（polyethylene，PE），聚氨基甲酸乙酯（Porous　segmented　Polyurethane）、膨体聚四氟乙烯（e－PTFE）等，并通过多种方法改变材料的物理性状、表面特点，以达到血管植入的要求。

1．在人工材料上打孔，使之形成多微孔结构，一可提高材料的顺应性，与自体血管弹性相匹配，二可使周围毛细血管内皮细胞通过微孔长入内膜层，覆盖内表面。Alexander．w．clowes证实ePTFE移植后形成内皮细胞层主要依靠周围毛细血管经微孔处长入，而不是吻合口两端内皮细胞的延伸生长，（两端的延伸仅约2cm），并指出完整的内膜层会减少平滑肌的过度增生。

2．采用各种可降解涂层以减轻血小板及血细胞的黏集，并希望随着涂层逐步降解，内皮细胞逐步爬行覆盖。Satoshi　Niu等采用多聚环氧化合物作交联剂，在人工血管上形成明胶—肝素涂层，抑制血小板的聚集、纤维素的形成，同时利于吻合口内膜的长入，Hiroyukin　kito在血管假体内表面涂布硫酸软骨素（CS）及透明质酸（HA），外表面涂以明胶层，以达到内表面抗血小板、血细胞吸附，外表面吸引周围组织长入的目的。Aruma　N在内膜剥脱的血管周围放置浸有内皮细胞的明胶海绵，以利于内皮细胞的迁移及通过旁分泌等作用减少内膜的增生。

3．有关人工血管内皮化的研究。由于内皮细胞在抗血栓形成、抑制血小板聚集、分泌血管活性因子等方面的重要作用，人们很早就设想在人工血管内表面形成内皮细胞的衬里，以达到模拟自体血管的目的。由于宿主内皮细胞由吻合口向人工血管内迁徙仅限于吻合口约2cm，而毛细血管通过管壁的长入、循环内皮在人工血管表面的沉积这两种途径的原因、机制及效果不清，有待进一步研究。于是将新鲜获取或体外培养的内皮细胞直接种植于人工血管的内表面，成为首选的努力方向。

（1）静脉内皮细胞的一期种植：1978年Herriy首次报道内皮细胞能在人工血管腔内形成内膜，James等将内皮细胞种植于经处理的Dacron材料上，并用于动物实验，可明显提高通畅率，降低血小板的激活率，Gherardini在内径1．5mm的e－PTFE上预先覆盖血清或胶原层，并采用旋转培养技术种植内皮细胞，用于动物实验可明显提高短期通畅率。

但由于获取的细胞数量太少，且种植的内皮细胞抗血流切应力差导致临床应用效果差。Jensen经5年随访，发现种植内皮细胞与不种内皮细胞的人工血管远期通畅率均十分低下，无明显差异。

（2）扩增内皮细胞的一期种植：针对常规方法内皮细胞数量缺乏而导致的种植失败，Matsuda运用微载体技术合并使用生长因子或肝素在短期内大量扩增内皮细胞及平滑肌细胞。

Jarrel　1996年报道可由大网膜脂肪、皮下脂肪中提取大量内皮细胞，他将皮下脂肪中提取的内皮细胞种植于e－PTFE内表面，荧光素分析3个月后形成的单细胞层主要来自种植的内皮细胞，并用于狗的颈动脉置换，实验结果满意，但迄今为止，未见有成功用于临床的报道，主要原因可能是由于种植的细胞不纯，导致的假内膜的增生。

（3）培养内皮细胞的二期离体衬里：Zilla将内皮细胞种植后，体外孵育8～9d，使内皮细胞形成完整的具有良好抗切应力及抗血栓的内皮层（主要是细胞骨架的分化成熟），这就是人工血管内皮细胞的离体衬里技术，1997年Deutsch报道该技术的临床结果，效果较满意。

但人工血管内皮化亦有不足之处，实验技术要求高，对急性亚急性患者不适用。在内皮细胞的来源、衬里技术等方面有待进一步的研究。更关键的一点，是对于口径小于6mm的人工血管远期通畅率都比较低，其中低灌注量是主要的影响因素，还有特殊部位（如膝关节以下等部位）的高阻力、移植材料弹性不匹配、弱而持久的异物反应、慢性炎症、细菌菌落积聚所导致的移植物感染等因素，这些都使得人工血管不适宜小口径血管的移植。Sayers报道人工血管口径小于6mm，6个月后通畅率小于40%。

这些非可降解的聚合物材料制成的人造血管直接植入体内后，会产生一系列的不良反应，形成血栓，堵塞管腔。而对管腔面进行生物化处理如包被蛋白，生物性材料或者接种血管内皮细胞的衬里，可以控制不良反应，但在体内，血流的冲刷，会导致人造血管管腔面生物材料的脱落，难以长时间维持管腔的通畅。

（四）组织工程再造血管的研究

随着组织工程概念的提出和研究的不断深化，人们转而研究利用多种血管有形成分与生物可降解材料复合合成组织工程血管。

1．组织工程血管的支架材料　一般分为生物性材料和非生物性材料两种。

生物性材料是指那些来源于生物体，由天然的生物大分子构成的材料。又可分为大分子无结构材料，如胶原明胶，藻酸盐等；去细胞纤维组织结构材料，如脱细胞小肠黏膜下层（SIS）、脱细胞的真皮基质、脱细胞的血管管腔基质等。生物性材料与细胞的亲和力强，能为细胞的生长分化提供近似于体内组织生长发育的ECM支架条件。

胶原是机体内最为丰富且普遍存在的结构蛋白，含有细胞黏附域序列（arginine－glycine－aspartic　acid，RGD）及细胞特定的识别信号。由于它的这一特性，其被广泛应用于组织工程各型支架的构建中。

而脱细胞基质材料是指采用一些特殊的方法去除组织中的细胞成分，保留其基本结构蛋白的空间构象，从而在结构、强度等方面与去细胞前相近。人们已经将多种组织（如小肠黏膜下层、心包膜、筋膜、血管、真皮等）制备成脱细胞的基质，加工成小管状，作为血管的替代物。

非生物性材料主要是一些通过化学合成的高分子可降解聚合物材料，目前常用的生物可降解材料有聚乙醇酸（polyglycolic acid，PGA），聚乳酸（polylactic　acid，PLA），或者PGA－PLA的共聚物（polylactic－polycolic　acid，PLGA），近年来还有聚羟基辛酯（polyhydroxyoctanoate，PHO），聚羟基烷酯（polyhydroxyalkanoate，PHA）等材料。它们具有可大量合成、材料的结构、降解速度等易于控制等优点，与细胞的天然亲和力不够是其主要的缺点。主要通过材料的不断改性、链接相关细胞识别分子得到改善。

2．组织工程血管的构建

（1）脱细胞基质材料的直接移植。用天然生物材料制成无生命（细胞）管型移植物，植入体内，通过受体的血管SMC、EC等细胞迁移和增殖，以细胞、ECM与骨架材料的整合，产生新的功能血管。

Huynh等用猪小肠黏膜下层脱细胞胶原基质制成内径4mm小管，腔面经牛胶原纤维包被，肝素复合物处理，抑制凝血反应。动物实验行兔动脉旁路术，术后4、8及13周检查，所有移植管通畅无阻塞，兔的SMC和EC逐渐迁入小管的骨架，术后3个月，综合受体细胞的胶原管重建成细胞化血管。

Wlison用狗的脱细胞血管（颈动脉）基质进行了同种动物动脉移植实验，显示了良好的相容性。

Love等应用特殊的快速移植法，用患者自身的心包膜制成小口径血管骨架。6个直径5mm，长5．5cm的自体心包膜制成小口径血管骨架，进行颈动脉移植，术后5个月，血管通畅率达100%。

脱细胞组织基质制备成无活性细胞生物材料移植物，方法简单，但用动物胶原制备的移植物，有无免疫排斥反应还有待进一步观察。

（2）体外模拟血管发育生理环境，构建具有生物活性的血管移植物。1976年Donald等从血管壁中切取400μM厚的弹性基膜，并在其上培养鼠动脉平滑肌细胞；以后更多工作主要集中于利用Ⅰ型胶原制备基质材料与各型血管壁细胞成分合成血管模型。Weinberg等1986年首先利用胶原与血管壁细胞成分构筑血管模型，先将培养基、胶原和SMC混合铸入管形容器，混合物凝结回缩，形成胶原管状网格支架（相当于血管中膜）；在支架外套上涤纶网；再接种FB构筑类血管外膜，2周后外膜成熟；向管内注入EC悬液旋转培养，1周后EC均匀贴附管内壁。合成的人工血管类似肌性动脉。电镜观察SMC完全分化，双极性细胞含纤维束和致密体；EC具有Weibel－Palade小体，分泌血管性血友病因子和前列环素，该TEBV对腔内压的耐受与尼龙网、胶原浓度、接种细胞密度及培养时间有关。该实验首次说明机体的血管可以人工构建，并可用人体细胞构建，但这种TEBV由于管壁弹性蛋白含量极少，SMC和胶原纤维排列杂乱，SMC密度和胶原量仅为天然血管的12．5%～25%，管壁抗压性很差。这与其中胶原力学强度低有关，也是动物实验和临床应用的最大障碍。

L′Heureux等采用三种血管细胞预先培养，再组合形成具板层结构类天然血管的生物材料TEBV。他们先分别培养人脐静脉SMC和人皮肤FB于培养瓶，用条件化培养液培育30d后，形成由细胞和ECM构成的膜片状培养物。将FB膜片从瓶壁上剥离，包裹在惰性管轴外继续培养，在成熟期膜片互相紧密黏合，产生圆柱状培养物。FB管膜经脱水处理制成无细胞的内膜（inner　mem－brane，IM）。组装时，将IM套在聚四氟乙烯多空管轴外，轴外径3mm。再裹上SMC膜片，制作血管中膜。此时将构建物置于生物反应器，培养液同时通过管腔和管外回流，支持管壁细胞生长；裹上FB膜作为外膜。待管壁细胞和ECM培育成熟；脱去中心管轴，管内接种EC。总时程3个月培育出了具有活性细胞的，并且类似机体血管板层结构的TEBV。该血管壁SMC和EC都表现出分化状态，血液相容性好，能耐受2　000mmHg的静水压，动物体内短期移植（7d）显示手术操作，缝合性良好。这种TEBV的制成，是血管组织工程领域一大突破，显示了通过细胞成分培养构筑功能性血管的可能性。血管力学强度与SMC及其产生的基质有关，改变培养条件，可促进细胞分泌ECM。这种构建模式体外培养设备不复杂，可以借鉴。但移植体内长期通畅率及血管稳定性有待考察，管壁力学强度需进一步提高。

Niklason等将SMC悬液注入生物可降解聚合物材料（PGA）制成管形支架中，细胞贴壁后，用模拟胎儿发育环境，能产生脉动流和环流的生物反应器培育。培育8周中，SMCs迁入PGA骨架内，其在PGA降解的同时，分泌胶原等ECM。当ECM与细胞一起形成的小管结构替代PGA支架时，管腔内接种EC。生物反应器使培养液在管腔中不断流动（产生一定的剪切应力），并通过脉冲泵的控制使流体产生有节律的脉动波。培育细胞成熟。该实验显示，脉动培养条件利于SMC迁移、分化表型表达（细胞内肌球蛋白量增多，细胞保持收缩反应，细胞有丝分裂率无增大）及细胞分泌胶原／ECM。体外培养可达到近似体内的细胞密度及胶原含量。在此种物理力学环境和优化培养液中培养出的血管，其机械力学性能优于先前任一组织工程 血 管，抗 撕　裂 程 度／静 水 压 大 于2　000mmHg，缝合固持强度达到90g，胶原含量超过50%。管壁细胞具有良好的分化状态，更新率低。血管对药物作用产生收缩反应。动物自体移植4周，TEBV仍通畅，血液流动良好，异体移植通畅性大于无脉动培养者。血管细胞对前列环素刺激有收缩反应，组织学检查，血管无炎性反应。这一模式首创脉动培养，革新体外TEBV培育条件，但所用设施复杂，一般实验室难以配置。

（3）利用机体的炎症反应，通过异构与移行形成血管。Campbell等取不同直径的硅性管插入大鼠或兔的腹腔，腹腔内充分发生的炎性反应使管面覆盖肌纤维母细胞、胶原基质和单层间皮，此时取出硅性管，分离小管与黏附的管型再生组织，翻转管型组织形成类动脉管，整体结构类似正常动脉。自体移植大鼠腹主动脉或兔颈动脉4个月，移植血管在体内继续发育并保持通畅。实验另辟蹊径，利用细胞对环境影响的适应性。该移植物由非血管成分的腹膜细胞构成，起始结构既不是动脉也不是静脉，移植后一旦置于动脉作用的生理环境，机体提供了一个潜在的细胞分化限定氛围，细胞则根据环境的需要而定向分化。

Tsukagoshi等取大鼠自体背筋膜10mm×40mm，缠绕在直径1．5mm硅胶棒上，将绕有背筋膜的棒植入大鼠大腿中部皮下，4周后取出。分离出硅胶棒，筋膜制成的纤维胶原管经抗凝血处理后，接入股动脉。术后保持通畅，无动脉瘤生成。5周后移植管新生内膜扩展至70%。

组织工程研究领域研究的不断深入，使组织工程血管的构建模式多样，虽然组织工程血管的最佳的构建模式尚未最后确立，但都向着高度生物相容性、可塑性、异物反应小、无致血栓生成、无感染等目标而努力，并且最终随着组织的长入，成为完全意义上的自体血管。这一研究将给心血管疾病的治疗，乃至组织器官的移植与再造带来曙光。

二、种子细胞的获得及培养

1．血管内皮细胞的培养　详见第4章第十节。

2．血管平滑肌细胞的培养

（1）原代培养：取新鲜的未足月引产死胎儿的胸、腹主动脉长约6cm，0．9%无菌生理盐水反复冲洗管腔内外，去除附壁的血细胞，剪除外膜多余脂肪与筋膜，酶消化法得到血管内皮细胞后，将管腔纵行剖开，用手术刀柄顺长轴方向轻刮2～3遍，去除残余内膜，然后用显微镊将中膜浅层和中层的组织撕成小条，将含成纤维细胞多的近外膜侧1／3的中膜弃去，剩余中膜用眼科剪刀将其剪成0．1cm×0．1cm×0．1cm大小的小组织块，用牙科探针将组织块均匀地拨散在直径10cm的培养皿中，37℃CO2培养箱中孵育2～3h，小心加入20%DMEM培养液浸没，3d后换液。

相差显微镜观察：组织块种植于培养皿后的第4天，在倒置显微镜下观察，可见VSMCs以垂直方向从组织块边缘迁移萌出。常常很快脱离组织块，然后零散生长成簇或从组织块向外生长形成细胞晕，进而形成细胞簇，其簇间相连呈网状结构。原代VSMCs的大小略有差异，形状多样。一般偏于长形、梭形、带状三角形或星形等。细胞伸出较长的突起相互接触，平行排列成束，成束的细胞向同一方向生长，形成典型的“峰与谷”样。VSMCs有一卵圆形或圆形明亮的核，核中有1～4个大小不一深色的核仁，细胞浆丰富，含少量颗粒。传代细胞的生长特性与原代细胞基本相同。传代间隔期一般是6～9d。接种于培养瓶中24h，多数细胞已贴壁伸展。开始时细胞呈圆形，不透明，边缘清楚，而后逐渐伸展，透明度增高，周界不清，呈典型的“峰与谷”生长。

（2）细胞传代。当原代培养的细胞达到相对融合状态时即可传代。传代时，弃去培养瓶中的生长液，以0．125%胰蛋白酶加入瓶中至覆盖细胞表面即可。于室温下消化30～60s，在倒置显微镜下观察，见到细胞收缩，聚集，立即翻转培养瓶，使细胞离开消化液。吸去消化液，加入适量培养液，用吸管将细胞与组织块自瓶底全部吹打下来，将细胞团块吹散，接种于新培养瓶中。一瓶细胞可分种两瓶，补足培养液，放于37℃培养箱中静置培养。当细胞长满成致密单层时，可照上法再传代（图16－1，彩图64）。

图16－1　细胞传代

在连续培养的过程中，镜下观察早期代次和晚期代次的细胞形态都是一致的。

（3）细胞鉴定：培养瓶中放置玻片，细胞贴壁生长在玻片上，取出长有细胞的玻片，置于PBS溶液反复漂洗，95%丙酮固定，漂洗后加入1．5%H2O2－PBS溶液37℃15min，PBS溶液漂洗，滴加鼠抗人α－肌动蛋白抗体（1∶50）4℃过夜。加马抗小鼠IgG，37℃30min（二抗）；加SABC复合剂37℃30min（三抗）。固定染色，免疫组化鉴定结果镜下可见阳性细胞的细胞质内有棕色颗粒，并作阴性对照（图16－2，彩图65）。

图16－2　细胞鉴定

VSMCs是动脉中膜中惟一的细胞。为了准确地取出中膜的内、中1／3的组织细胞，防止外膜的成纤维细胞混杂，获得高浓度的VSMCs培养细胞，最好能在解剖显微镜下确定正确的位置，熟练取材。中膜结构致密，反光性强，外膜结构疏松，呈粉红色。一般来说，供者年幼，其VSMCs成活率高。

3．成纤维细胞的培养　将手术切下的新鲜皮肤洗净血迹，去除表皮及皮下组织，在无菌条件下反复剪切成0．5～1mm3的微小组织块，贴附于培养瓶底面，置于37℃、5%二氧化碳细胞培养箱内静置培养4h，加入含胎牛血清（20%）、青霉素（100μg／ml），链霉素（100μg／ml）的DMEM培养液适量，继续培养，每4～6d用含20%胎牛血清的DMEM换液1次，3～4周可生长成片。用0．25%胰蛋白酶消化细胞成单层，按1∶2或1∶3的比例进行传代培养，每4～6d用10%小牛血清DMEM换液1次。实验采用第4～10代细胞。

三、基质材料的筛选

目前组织工程用的可降解材料很多，与其他组织研究所用的材料相类似。笔者将血管平滑肌细胞接种在几种现有的可降解基质材料膜片上，采用MTT法检测膜片上细胞的生长情况，描记生长曲线，以期筛选出适合于组织工程血管构建的可降解基质材料。

由平滑肌细胞在几种基质膜片上的生长曲线及扫描电镜上可以看出平滑肌细胞在胶原／PGA、胶原／黏多糖以及脱钙骨三种基质膜片上生长良好（图16－3），经过2周的培养，细胞之间融合成片，并分泌大量的细胞外基质，说明上述三种材料比较适合血管平滑肌细胞的生长（图16－4）。其中胶原＋PGA膜及脱钙骨效果更佳。单纯的胶原膜易受胶原酶的作用而降解较快，且机械强度、弹性等物理性状均较差。而PGA加胶原或黏多糖加胶原后的基质材料具有一定的弹性及韧性，指压后可恢复原状，并有较强的亲水性。脱钙骨本身就具有多微孔结构，亲水性好，吸水后有轻度的溶胀性，弹性和韧性最佳。三者是较理想的组织工程血管的实验用支架材料。其中脱钙骨材料可在倒置显微镜下观察到细胞在孔洞的内表面贴附、生长，并逐渐闭合孔隙。

图16－3　在三种基质膜片上生长良好的细胞

图16－4

四、管型支架的制作

血管是一种由内膜、基底膜、中膜、外膜等四层结构构成的特有的管腔器官。要构筑血管模型，必须先行制备管形支架的模型。我们手中所掌握的可降解材料均是片状的，采用模具浇铸，冻干成形技术得到几种管形的支架材料（图16－5，彩图66）。

图16－5　管型支架材料

选用Ф15mm×100mm的玻璃管，中间插入外径6mm，内径4mm的硅胶管，底部用医用胶黏合固定，向玻璃试管和硅胶管之间的腔隙中分别注入胶原加黏多糖、胶原加壳聚糖两种胶冻状基质（注入时速度要快，均匀，沿管壁注入，不产生气泡）。置于－20℃冰箱中，均匀冷冻24h。将已冻成的基质冰晶小心地从玻璃管中取出，置于真空序列冻干机中冻干。其中－40℃24h，－20℃24h，0℃24h，20℃24h。

冷冻干燥技术是医药和食品工业中常用的制备方法。通过冷冻干燥的过程可以制备具有高互穿性的开放多微孔结构。将聚合物溶液或凝胶在低温下进行冷冻，溶剂结晶形成冰晶，在低于冰点的温度下抽真空，溶剂升华后形成多孔结构。对于胶原的溶液，水均匀散布于其结构中，经过冷冻形成冰，在0℃以下真空干燥。水在这里就起到制孔剂的作用，形成的冰晶成为多孔结构的形状模板。这种方法只使用水就能够提供尺寸均匀的孔性结构，不使用其他的溶剂，并且都是在低温和室温下操作。因此不会影响到材料的生物学活性。

支架的多孔状结构主要由所形成的冰晶的形状和大小来决定，而冷冻的温度对冰晶的大小和形状起到决定性的作用。通过降低冷冻的温度，提高冷冻的速度可以得到孔径较小的支架。

采用模具直接成形、冷冻干燥技术相结合，可以得到多种管状的可降解基质支架模型，外径10mm，内径0．6～0．8cm，具有一定的弹性及韧性，放置培养液中10d，可保持管腔形状，不塌陷、不变形，指压后可恢复原状，并有较强的亲水性，可满足实验所需。

五、三种接种培养方法的比较

细胞与材料支架的黏附是形成组织的第一步也是关键的一步，对于种子细胞的来源本身就比较有限，不能无限度的扩增，怎样充分利用种子细胞，提高接种效率是我们所关心的问题。

参考国外的相关文献，笔者试验了三种接种方式：

取3～7代生长状态良好、稳定的血管平滑肌细胞，经0．25%胰酶消化，经离心后，测细胞悬液浓度为1．8×106／ml，向三个离心管中分别加入1ml，加入10%DMEM培养液4ml，则每管的接种终浓度为9×105个／ml。

将卷成管状的脱钙骨分别裁剪成同等大小、口径的三段，分别置入三个上述离心管中，采用三种方法培养。

1．静态接种培养，即放入到CO2孵箱中处于静止状态下培养。

2．水平摇床培养，24h，摇床速度30r／min。

3．旋转接种培养，采用自制的旋转培养装置，24h，旋转速度60r／min。

24h后，将管状的材料换至新的离心管中培养，10d后，标本分别送扫描电镜观察。

充分消化原离心管中的细胞，吹打均匀后，在显微镜下严格细胞计数，计算剩余的细胞数（在整个操作过程中，每组的实验条件尽可能保持一致，包括吹打的次数及力度等）。

接种率＝（接种的细胞总数—剩余细胞数）／接种的细胞总数

反复接种实验三次，三种方法取平均值。

结果：静态接种只能有少量的细胞贴附于材料上，而两种动态的接种（水平摇床和旋转接种）可以明显提高细胞与材料的黏附率，分析原因：由于材料是一种多微孔结构，静态下只有和材料纤维接触的细胞能够贴附、伸展。绝大多数的细胞只是沉积在材料纤维之间的空隙中，缺乏与材料纤维发生相互作用的机会。而动态的接种能够提供更多的机会让细胞与材料发生接触，从而提高细胞的贴附率。

旋转培养装置其原理与美国Genzyme公司的RCCS（Rotary　cell　culture　system RCCS）系统相仿，通过微型电机的驱动，减速装置的作用使旋转臂绕其水平轴心做缓慢匀速转动，根据国外文献的经验，我们将转速调整到60r／min，由装置的带动，管状支架在细胞悬液中，缓慢地绕着自身中轴旋转，可促进细胞在支架纤维上的贴附。水平摇床和旋转培养相比，差异也比较显著，以旋转接种的效率最高，机制不明，可能与水平摇床在搅动的过程中形成湍流，搅动的过程产生的切应力不利于细胞的贴附等因素有关。Carrier也证实旋转反应器中的层流环境要优于摇瓶中的湍流环境。旋转装置可以使培养基、细胞颗粒、材料随容器而一起旋转，将各种破坏性应力降至最低，同时还能提供给细胞和材料纤维之间充分的接触机会，增加细胞的贴附率。也使细胞在管腔的各个层面贴附生长得更加均匀。

通过旋转培养装置使在体外培养三维组织器官及不同种细胞的共同培养成为可能。国外已经开发用于组织工程肝脏、骨髓等器官的再造，也可用于建立肿瘤、AIDS、肾病等研究的实验模型。

六、血管生物反应器的研制

组织工程血管的构建主要面临着两个难题：①种植的内皮细胞层不能耐受血流的冲刷而脱落，引起继发性的血栓形成，降低其远期的通畅率；②在体外静态下形成的组织工程血管缺乏足够的弹性中膜支撑，不能达到或接近正常血管的结构强度。针对上述问题，笔者自行研制了一种用于组织工程血管构建的新型生物反应器。

1．材质毒性实验　首先对实验中所要用到的材质细胞毒性实验，整个实验的方法参照国家药监局关于体内植入物临床验证的实验细则而施行。将几种材质的浸提液用于细胞的培养，用MTT方法描记细胞的生长曲线。

从生长曲线上可以看出成纤维细胞在PMMA以及硅胶管浸提液中生长状态如常，而在乳胶管的浸提液中生长受到抑制，到后期甚至出现细胞数目的减少，与我们所观察到的细胞收缩、变圆，飘起的情况相吻合。说明PMMA和硅胶管的材质无细胞毒性，可以用做反应器部件的构成。乳胶管则不能用于实验用。

2．生物反应器的研制　反应器整体由灌流部分、控制部分、驱动回路三部分组成。灌流部分由四个独立的灌流小室构成；反应器的灌流部分、压力表、电磁阀、液体的回收瓶等构成一个闭合的回路，回路中流体的驱动由恒流泵提供；蠕动泵提供整个流动回路中的动力，使水流按指定的方向单向流动；压力传感器可感受回路中水流的压力大小，控制器部分采用可编程控制器（PLC），通过给定压力的大小及控制电磁阀的定时开、闭，以形成搏动（脉动式）的水流（图16－6，彩图67）。

图16－6　生物反应器

3．搏动培养的理由　Weinberg等1986年首先利用胶原与血管壁细胞成分构筑血管模型，Ziegler与Nerem　1994年将平滑肌细胞与胶原明胶复合培养平滑肌组织，但所形成的血管模型物理性状较差，弹力及抗压力较低。Nicolas　L′Heureux1999年通过首先将平滑肌细胞与成纤维细胞分别培养形成细胞层，将成纤维细胞层脱水去细胞形成内膜（IM），外裹平滑肌细胞和成纤维细胞层，经过体外8周成熟期后，内壁注入内皮细胞使之内皮化，结果从机械强度、血液相容性、可缝合性等方面效果满意。但整个制备过程须经长时间的成熟期（约需3个月），其后期效果尚有待进一步观察。而采用PGA、PLGA等材料复合平滑肌细胞的静态种植，体外培养4周后发现，尽管可形成部分类组织样结构，但形成的结构松脆，不能耐受血流的压力。

同时大量的研究表明，在培养过程中，应用生物力学因素，特别是搏动时的张力作用于细胞－材料复合物，对细胞的生长、分化、繁殖大有益处，Byung－Soo　Kim证实环状张力可刺激血管平滑肌细胞的增生，促进细胞的定向排布，增加平滑肌细胞的收缩特性。Niklason证实搏动的张力可增加细胞－材料复合物中胶原含量及细胞中肌动蛋白重链的表达。

另一方面，以往种植的内皮细胞之所以不能耐受血流的冲刷脱落，主要与细胞一直处于静态、无切应力作用的环境有关，也就是说种植的内皮细胞在生长过程中，缺乏抗血流冲击的“训练”。研究表明：内皮细胞与基质的牢固结合依赖细胞内微丝形成的应力纤维（stress　fiber）。在非流动的环境下形成的内皮细胞，其微丝主要以分布在细胞周围的致密周围束的形式出现，细胞中间没有粗大的微丝束，只有少量短的微丝随意分布；而体外给予较小的剪切应力，内皮细胞即使没有形态的变化，细胞的中央也出现应力纤维，说明切应力有诱导内皮细胞形成应力纤维的作用。在细胞贴附生长过程中，从弱到强逐步给予切应力的刺激，可促使内皮细胞内应力纤维的“分布再塑”，同时细胞的形态和排列方向也发生顺应性的改变。

基于以上考虑，设计这一生物反应器就是将生物力学因素引入组织工程器官的构建过程中。

目前组织工程器官理想的培养环境、条件尚不清楚，根据国内外文献的报道，适当的搏动张力（小于10%）不会影响平滑肌细胞分泌FGF2（成纤维细胞生长因子：可明显促进各型细胞生长增殖的细胞因子）；同时可选择性抑制金属蛋白酶（MMPs）的分泌（MMPs对细胞外基质特别是Ⅰ型胶原有特殊的消化作用）。而较高的搏动张力可抑制内皮细胞及平滑肌细胞的生长及分泌功能。

采用5%的搏动张力及逐步增加的搏动频率，以期尽量模拟体内的生理环境，以利于组织的形成及细胞的适应性再塑。同时，适当时间的体外培养可减少形成物中可降解材料的组分，从而减少机体对其的异物反应。

该装置可模拟人体血管搏动刺激及血流的冲刷作用。一方面可使内皮细胞层逐步耐受流体冲刷的切应力，减少细胞的脱落。另一方面搏动性的刺激可促进血管平滑肌细胞的生长、繁殖及分化。

该生物反应器结构简单、便于操作，可长时间维持无菌小环境，组合后可置入CO2孵箱中，为细胞的生长提供稳定的环境。同时该装置亦可用于组织工程心脏瓣膜等器官的体外培养。将生物力学因素引入组织工程器官的构建过程中做一新的尝试。