各类软骨组织构建

各类软骨组织构建_组织工程学实验技

前已述及组织工程技术构建软骨及修复软骨缺损的重要意义，并以猪膝关节软骨缺损模型为例简单地介绍了软骨缺损动物模型的建立方法及注意事项。本节将分别以皮下软骨构建（弹性软骨细胞）、关节软骨缺损修复（透明软骨细胞）及半月板软骨缺损修复（纤维软骨细胞）为例介绍三种类型软骨组织的构建方法及组织工程技术修复软骨缺损的一般过程。

由于不同类型的软骨在体内存在部位不同，功能各异，因此，在软骨组织构建研究中，必须根据其各自的特点选择适当的种子细胞与生物材料，并根据各自缺损修复的需要，对生物材料支架进行塑形。

主要实验材料准备与第4章第三节软骨细胞培养基本一致，所不同的是在软骨构建过程中会根据需要选用不同的种子细胞与生物可降解支架材料。

一、弹性软骨构建方法

弹性软骨在人体内主要分布于耳郭及会厌等处，目前会厌软骨构建的研究相对较少，因此，这里简单介绍一下以耳郭软骨细胞作为种子细胞在皮下组织中构建弹性软骨的主要操作过程。

（一）实验动物的选择

前面第4章第三节中已简要地介绍了猪耳郭软骨细胞的培养方法，这里仍以8～10周龄仔猪作为实验对象。由于某些材料如聚羟基乙酸（PGA）在免疫功能完全的动物体内会引起严重的炎症反应，所以对于这类材料一般要在体外或在裸鼠皮下进行软骨构建。

（二）耳软骨细胞分离、培养与扩增

操作方法及注意事项同第4章第三节耳软骨细胞分离与培养。在常规培养条件下，一般用3代以内的耳软骨细胞进行弹性软骨构建。

（三）生物支架材料的选择

最简单实用的皮下软骨构建生物材料为聚氧化乙丙烯（Pluronic　F－127），它的最大优点是在0～4℃时能配制成可流动的液体，容易与细胞混合均匀，而在室温或注射到动物体内后则形成不流动的凝胶状，操作方便，既能进行一定程度的塑形，又不致引起细胞流失。此外，在皮下软骨构建研究中，也可根据不同研究需要选用胶原、纤维蛋白凝胶、壳聚糖／明胶膜、PGA、PGA－聚乳酸共聚物（PLGA）等。

（四）细胞－材料复合物制备及体内植入

细胞培养扩增方法前已述及，实验时将体外培养3代以内的耳软骨细胞消化、收集、计数备用。细胞－材料复合物的制备过程依所用生物材料不同而有较大的差别，这里分为液体材料（水凝胶类）及固体材料两大类做一简要的介绍。

1．当所用生物材料为液体（如Pluronic F－127、纤维蛋白凝胶等）时，应先将细胞悬液离心，弃去上清液，浓缩的细胞团打散，直接加入液体材料振荡混合均匀，再用注射器将细胞－材料复合物注射到动物自体皮下或裸鼠皮下。通常情况下，可注射性细胞－材料复合物中软骨细胞的终浓度为（4～5）×107／ml。下面以Pluronic　F－127为例介绍具体操作步骤如下：

（1）材料准备：将Pluronic　F－127溶于PBS，配制质量百分比约30%的Pluronic－PBS凝胶，置于0～4℃冰箱内磁力搅拌过夜，使Pluronic均匀溶解于PBS。高压灭菌后再置于0～4℃冰箱内备用。

（2）细胞准备：收集3代以内的耳软骨细胞计数备用。

（3）细胞－Pluronic复合物制备：细胞悬液离心，弃去全部上清液，将浓缩的细胞团打散，置于冰盒内预冷5～10min。根据细胞计数结果，按5×107／ml的细胞浓度计算应加入30%Pluronic－PBS凝胶毫升数，用已预冷的无菌注射器（带刻度）吸取相应量的Pluronic－PBS凝胶，加入上述含细胞的离心管内，再置于冰盒内继续预冷5～10min，在振荡器上将细胞与凝胶混合均匀，转移到已预冷的无菌注射器中。注射前将细胞－Pluronic复合物置于室温或操作者手掌内3～5min，复合物形成不流动的凝胶状时即可进行皮下注射。

（4）皮下注射：动物麻醉（猪以氯氨酮10～20mg／kg肌注麻醉，裸鼠以乙醚麻醉）成功后，根据实验设计要求将细胞－Pluronic凝胶注射到相应的动物皮下并做好注射部位标记。猪自体注射时一般选腹股沟区操作及随访观察较为方便（因此处皮肤薄，皮下组织也相对较少），裸鼠皮下注射时一般选背部较为方便。注射过程中及注射后均可根据实验设计要求对已注射到皮下的细胞－凝胶复合物进行一定的预塑形。

2．当所用生物材料为固体（如壳聚糖／明胶、PGA等）时，可根据实验需要先将支架材料预制成各种形状，消毒后备用。支架材料在接种细胞前最好先进行预培养并初步测定其吸水能力，以避免材料污染并确定每块支架材料能接种细胞悬液的最大体积。通常情况下，细胞－材料复合物中软骨细胞的最终密度为（4～5）×107／mm3。接种时可根据支架材料的体积及这一细胞密度确定每块材料所需的细胞量。下面以PGA支架为例介绍具体操作步骤如下。

（1）材料准备：将PGA纤维预制成片状、圆柱状等各种需要的形状，对于较为精确而复杂的形状可滴加少量1．5%的聚乳酸（PLA）二氯甲烷溶液以固定支架形状。制备好的材料支架浸于75%乙醇（V／V）中消毒30min～1h，PBS反复冲洗3次后，加入含10%FBS的DMEM中培养24h后备用。

（2）细胞准备：收集3代以内的耳软骨细胞，计算细胞总数。细胞悬液离心，弃去上清液，将浓缩的细胞团打散，根据支架材料体积、吸水能力测定结果及要接种的最终细胞密度，加入适量的培养液，调整细胞悬液浓度，一般应达到（5～6）×107／ml。

（3）细胞－PGA复合物制备：尽量吸除材料支架内的培养液，转移至另一新的培养皿内。将上述高浓度的细胞悬液振荡混匀后，均匀地滴加到材料支架上，滴加细胞悬液的最大体积不能超过材料支架的最初总体积。

（4）复合物体外培养与观察：将制备好的细胞－PGA复合物置于37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养4～5h，待细胞充分黏附于PGA纤维后，加入含10%FBS的DMEM常规培养。培养过程中注意观察细胞与材料的黏附情况及细胞外基质分泌情况。活力良好的耳软骨细胞在培养4～5h后能全部黏附于PGA纤维支架上，24～48h时已出现明显的细胞外基质分泌，细胞可形成膜片，边缘处可见细胞呈蛛网状包裹PGA纤维，支架内部因大量细胞及细胞外基质存在而变得不透明。体外培养1周后，即可植入皮下进行体内软骨构建。根据实验目的不同，软骨细胞－PGA复合物也可以在体外进行软骨构建，经过8～10周的体外培养，复合物在体外可形成良好的软骨组织。

（5）皮下植入时间选择：PGA纤维植入猪皮下可引起严重的炎症反应，所以猪自体的皮下植入实验应在体外软骨基本形成，PGA纤维已大部分降解后才能进行。PGA纤维植入裸鼠皮下不引起明显的炎症反应，所以，裸鼠皮下植入实验在体外复合物形成后的任何时间均可进行。一般是在体外培养1周后进行，此时软骨细胞已充分黏附于PGA纤维并已有一定量的细胞外基质分泌，有利于体内软骨形成。

（6）裸鼠皮下植入：裸鼠以乙醚麻醉，75%乙醇消毒背部皮肤。一般取背部横切口，皮下钝性分离形成皮下间隙，植入软骨细胞－PGA复合物或体外培养的类软骨样组织，切口仔细缝合。

（7）猪自体皮下植入：麻醉（猪麻醉方法参见本章第一节软骨缺损动物模型建立）成功后，手术部位（一般选择腹股沟区或侧腹部）备皮、消毒、铺无菌巾。切开皮肤深达皮下组织，在皮下组织浅层钝性分离形成皮下间隙，结扎明显的出血点后，植入体外培养的类软骨样组织，切口仔细缝合。术后肌注青、链霉素抗感染治疗3～5d。

（五）新生软骨取材与相关检测

1．皮下软骨取材时间　皮下环境中组织工程化软骨形成时间一般为6～10周。软骨细胞与可注射性材料组成的复合物植入体内6周时已能形成成熟的软骨样组织。细胞与固体支架材料组成的复合物植入体内后形成软骨的时间不同材料有所差异，主要与材料本身的降解时间及体外培养时间有关。如PGA纤维在皮下组织中的降解时间约6～8周，所以皮下成熟软骨形成的时间也在8周左右。但如果体外培养时已形成了接近成熟的软骨样组织，则在体内的软骨成熟过程会明显加快。

2．组织工程化软骨的检测与评价指标

对皮下新生软骨的检测与评价主要包括大体观察、软骨体积与湿重、组织学检测、生物力学检测及软骨特异性基质含量的定量半定量检测等，具体方法参见本章第三节组织工程化软骨检测技术。

（六）皮下软骨构建实验要点

1．软骨细胞的功能和数量是决定组织工程化软骨能否形成的两个最重要影响因素。活力较差或多次传代的软骨细胞很难在体内形成软骨组织，即使是活力和功能均良好的软骨细胞，如果细胞接种浓度低于1．0 ×107／ml也不能在体内形成良好的软骨。因此，在进行软骨构建时，必须同时兼顾软骨细胞的功能及数量。

2．制备细胞－Pluronic复合物时，所用的物品均须预冷处理，复合物混合的操作过程最好在4℃冷藏室内进行，使Pluronic凝胶处于液体状态，确保其能与细胞充分混匀。

3．皮下注射时，应先将细胞－Pluronic复合物置于室温或操作者手掌内预热3～5min，使复合物形成不流动的凝胶状再进行注射，这样可保证细胞高浓度集中在注射的局部区域。

二、透明软骨构建方法

透明软骨在人体内主要分布于关节表面、肋软骨、气管、鼻软骨等处，组织工程研究最多的是关节软骨，因此，这里简单介绍一下以关节软骨细胞作为种子细胞修复关节软骨缺损的一般操作过程。

（一）实验动物的选择

本章第一节软骨缺损动物模型建立中已提及，猪的膝关节在结构、功能及软骨厚度上与人非常接近，是良好的关节软骨缺损研究模型。因此这里仍以猪膝关节软骨缺损模型为例介绍关节透明软骨构建方法及关节缺损组织工程技术修复的一般过程。

（二）关节软骨细胞分离、培养与扩增

操作方法及注意事项同第4章第三节关节软骨细胞分离与培养。在常规培养条件下，一般取3代以内的关节软骨细胞进行关节缺损修复研究。

（三）生物支架材料的选择

常用的关节软骨构建生物支架材料包括胶原、纤维蛋白凝胶、壳聚糖／明胶膜、PGA、PLA包埋的PGA支架、聚羟基乙酸－聚乳酸共聚物（PLGA）等。本节以PLA包埋的PGA支架为例做一简单介绍。

（四）细胞－材料复合物制备

1．PGA／PLA材料支架制备　将非编织的PGA纤维称量约30mg／份，均匀地嵌入已制备好的直径8mm、高5mm的圆柱形硅橡胶模具内（模具大小与软骨缺损模型大小基本一致），加入1．5%的PLA液（以二氯甲烷为溶剂）0．3ml，待其自然干燥后取出真空保存备用。应用时将制备好的材料支架浸于75%乙醇（V／V）中消毒30min～1h，PBS反复冲洗3次后，加入含10%FBS的DMEM中培养24h后备用。

2．关节软骨细胞准备　细胞培养扩增方法前已述及，实验时将体外培养3代以内的关节软骨细胞消化、收集、计数备用（如细胞量充足，也可直接应用原代消化收集的关节软骨细胞）。应用时细胞悬液离心，弃去上清液，浓缩的细胞团打散，根据材料支架体积、吸水能力测定结果及要接种的最终细胞密度，加入适量的培养液，调整细胞悬液浓度，一般应达到（5～6）×107／ml。

3．细胞接种　尽量吸除材料支架内的培养液，转移至另一新的6孔板内。将上述高浓度的细胞悬液振荡混匀后，均匀地滴加到材料支架内部，滴加细胞悬液的最大体积一般不超过材料支架的最初总体积（约0．25ml）。

（五）复合物体外培养与观察

将制备好的细胞－PGA／PLA复合物置于37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养4～5h。如果应用的细胞为原代关节软骨细胞，因细胞黏附较慢，培养时间应延长至6h以上。待细胞充分黏附于PGA纤维后，再加入含10%FBS的DMEM常规培养。培养过程中注意观察细胞与材料的黏附情况及细胞外基质分泌情况。活力良好的关节软骨细胞在培养4～5h后均能良好地黏附于PGA纤维上，24～48h时可见到明显的细胞外基质分泌，关节软骨细胞也可以形成膜片并呈蛛网状包裹PGA纤维，支架内部因大量细胞及细胞外基质存在而不透明。同期培养单纯PGA／PLA材料支架作为对照。

（六）皮下植入时间选择

PGA纤维在猪关节缺损一般不会引起严重的炎症反应，所以复合物植入体内修复缺损的时间没有严格的限制，甚至不经过体外培养的细胞材料复合物也可以直接用软骨缺损的修复。多数研究倾向于体外培养1周后再进行体内缺损修复，此时细胞已充分黏附于PGA纤维并已有一定量的细胞外基质分泌，有利于体内软骨形成。

（七）复合物体内植入修复关节软骨缺损

动物麻醉及关节软骨缺损制造方法和操作过程可参见本章第一节软骨缺损动物模型建立。一般可在每个膝关节内外侧髁各做1个缺损，双侧共4个缺损，实验组用细胞－材料复合物修复，对照组可用单纯材料支架修复或空白不修复。术后肌注青、链霉素抗感染治疗3～5d。

（八）关节缺损修复结果评价与相关检测

1．关节缺损修复取材时间　大动物关节软骨缺损修复观察的时间点一般应包括术后3个月、6个月及1年以上。3个月时主要观察缺损修复的早期情况，包括缺损修复的充盈度，新生组织的成熟程度及软骨下松质骨的修复情况。6个月时主要观察缺损内修复组织的改建与重塑，组织学特征，生物力学特性及生化组成。1年以上时取材，主要观察修复的远期效果及修复的关节表面软骨是否会发生骨化。

2．组织工程技术修复关节软骨缺损的检测与评价指标　对关节缺损修复的检测与评价指标主要包括大体观察、组织学检查、生物力学检测及软骨特异性基质含量的定量半定量检测等。此外，还可根据大体观察与组织学检查结果，对修复结果进行分级评价（表10－2）。具体方法参见本章第三节组织工程化软骨检测技术。

表10－2　关节软骨缺损修复大体观察与组织学检查分级

（九）关节软骨缺损修复实验要点

1．为进行科学的疗效评价，实验组与对照组缺损的位置必须对称，缺损的大小、深度也尽量一致，以保证局部微环境和机械负荷对缺损修复的影响在各处理组间的均衡。

2．植入细胞－支架复合物或单纯支架材料时，最好用可吸收缝线“十字”交叉缝合固定以免植入物脱落。

3．关节内无血供，抗感染能力低，易化脓形成关节内积液而导致实验失败。手术时必须严格无菌操作，术后分层认真缝合。其他同皮下软骨构建。

三、纤维软骨构建方法

纤维软骨在人体内主要分布于半月板、椎间盘等处，纤维软骨组织构建在组织工程研究相对较少，这里简单介绍一下以半月板纤维软骨细胞作为种子细胞修复膝关节半月板纤维软骨缺损的主要操作过程。

（一）实验动物的选择

前面第4章第三节软骨细胞培养中已介绍了猪半月板软骨细胞的培养及扩增方法，猪的半月板在结构、功能等诸多方面也与人非常接近，是良好的纤维软骨缺损研究模型。因此这里以猪膝关节半月板软骨缺损模型为例，介绍纤维软骨构建方法及半月板缺损组织工程技术修复的一般过程。

（二）纤维软骨细胞分离、培养与扩增

操作方法及注意事项同第4章第三节半月板软骨细胞分离与培养。在常规培养条件下，一般以3代以内的半月板软骨细胞进行缺损修复研究。

（三）生物支架材料的选择

因半月板缺损修复研究相对较少，本实验仅尝试了Pluronic与PGA相结合作为材料支架的修复方法，因此，我们就以这一支架材料为例进行介绍。

（四）细胞－材料复合物制备

1．PGA材料支架制备　将非编织的PGA纤维称量约15mg／份，手工制成8mm ×10mm厚度均匀的片状支架。应用时将制备好的材料支架浸于75%乙醇（V／V）中消毒30min～1h，PBS反复冲洗3次，在含10%FBS的DMEM中培养24h后备用。30%的Pluronic　F－127配制方法同弹性软骨构建。

2．纤维软骨细胞准备　半月板细胞培养扩增方法参见第4章第三节软骨细胞培养。实验时将体外培养3代以内的半月板纤维软骨细胞消化、收集、计数备用。

3．细胞－生物材料复合物形成　①细胞悬液离心，弃去全部上清液，浓缩的细胞团打散，置于冰盒内预冷5～10min；②根据细胞计数结果，按3．5×107／ml的细胞浓度计算应加入30%的Pluronic－PBS凝胶毫升数，用已预冷的无菌注射器（带刻度）吸取相应量的Pluronic－PBS凝胶，加入上述含细胞的离心管内，再置于冰盒内继续预冷5～10min；③在振荡器上将细胞与Pluronic凝胶混合均匀，形成细胞－Pluronic复合物，将复合物吸入注射器置于冰盒内备用；④吸除PGA纤维支架内的培养液，置于冰盒内预冷5～10min后，将细胞－Pluronic复合物均匀地滴加到PGA纤维支架内，形成细胞－Pluronic－PGA复合物，常温无菌条件下备用。

（五）复合物体内植入修复半月板软骨缺损

1．缺损模型的制备　动物麻醉方法同关节软骨缺损修复。麻醉平稳后，动物后肢膝关节备皮，常规消毒铺无菌巾，手术肢体膝关节以下用无菌巾包裹。膝关节屈曲90°位，在髌韧带内缘与髌骨下极的交点向内旁开0．5cm为起点由内下方行略突向外下的斜弧形切口约3～4cm，分离皮下组织和浅筋膜，旁开髌韧带内缘0．5cm纵形切开关节囊，暴露内侧半月板前半部，切断其附着于胫骨平台边缘的冠状韧带，保留半月板前角，于内侧副韧带前方的半月板周围面做间隔1cm长的一对刻痕；以拉钩保护内侧副韧带，切去刻痕间的全层半月板。

2．缺损的修复　用4－0可吸收缝线将一张2．5cm×3．5cm多孔生物膜桥接并包绕缝合两断端，于断端间填入PGA－细胞－Pluronic复合物，对照组以无细胞的Pluronic－PGA支架修复或旷置缺损。生物膜对合后一并固定于胫骨平台边缘，即修复冠状韧带。彻底止血后，仔细修复关节囊，分层关闭切口。待动物苏醒送回动物饲养房，不限制其笼内活动。术后常规肌注青、链霉素抗感染治疗3～5d。

（六）半月板缺损修复结果评价与相关检测

1．半月板缺损修复取材时间　一般于术后3个月、6个月及9个月时取材。3个月时主要观察缺损修复的早期情况，包括缺损修复的充盈度，新生组织的成熟程度及其与周围正常组织交界处的修复情况等。6个月时主要观察缺损内修复组织的改建与重塑，组织学特征，生物力学特性及生化组成。9个月时主要观察缺损修复的中远期效果。

2．组织工程技术修复半月板软骨缺损的检测与评价指标　与关节软骨缺损修复类似，主要的检测与评价指标包括大体观察、组织学检查、生物力学检测及软骨特异性基质含量的定量半定量检测等。具体方法参见本章第三节组织工程化软骨检测技术。

（七）半月板软骨缺损修复实验要点

基本与皮下软骨构建及关节软骨缺损修复相同。除注意调整好细胞活力及接种数量外，手术过程中更应注意无菌操作并尽量减少创伤，有效恢复正常关节结构，防止术后关节内粘连。