组织工程骨及其血管神经的同步构建

骨缺损的良好修复必须依赖充分的血供，新生血管不仅是氧气、营养物质及代谢废物运输的通道，而且是参与骨修复调控的细胞、信号分子通过的重要路径，即血管化（angiogenesis，vascularization）和骨再生是骨愈合过程中的两个最基本环节。体外构建的组织工程化骨，植入体内后同样必须迅速建立充分的血供，为种子细胞功能活动提供充足的营养，只有这样才能保证组织工程化骨的成活及骨缺损的修复，这在完成较大骨缺损修复时显得尤为重要。

创伤愈合中血管生成的机制在创伤愈合过程中，血管生成是一个包括细胞、生长因子、细胞外基质、生物力学刺激等多因素相互作用的复杂过程，其基本过程包括：①血管新生启动阶段，在缺氧时或某些细胞因子作用下，以血管通透性增加为特征；②进展阶段，蛋白水解酶降解细胞外基质，EC脱离并穿过血管壁进入细胞外基质，形成结节状或锥体状血管芽；③形成阶段，单个血管芽生长变形形成血管腔，并与邻近血管芽相互吻合成血管网；④塑形和改建阶段，血管平滑肌或其他细胞迁移包绕新生血管，产生细胞外基质，进而形成完整的血管壁结构；待创伤愈合后，部分新生血管将蜕化。

一、生长因子的应用

Hanahan认为血管生成受血管生成促进因子和血管生成抑制因子的共同调控，生理状况下血管生长受到严格调控，当正负调控因子失去平衡时则会出现病理性血管生成。促进血管生成的因子主要为VEGF、BMP、碱性成纤维细胞生长因子（basic　fibroblast　growth　factor，bFGF）、血管生成素（angiogenin，Ang）、血小板衍化生长因子（platelet　derived　growth　factor，PDGF）、转化生长因子－β（transforming　growth　factorβ，TGF－β）、表皮细胞生长因子（epidermal growth　factor，EGF）等；抑制血管生成的因子有血管抑素、内皮抑素、血小板因子－4等。生长因子和血管化生长因子在血管化过程中起着重要作用。

（一）VEGF在骨髓基质干细胞中的转染

血管内皮细胞生长因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）在血管形成中是一个基本的调节因子，它在胚胎的血管形成过程中是必不可少的，并且为长骨生长和软骨化骨所需。VEGF具有高度保守性，两个相同亚基以二硫键交联结合成二聚体糖蛋白。它是血管生成初期最重要的促进因子：首先，通过肝素样分子的调节，VEGF与相应受体结合引起受体自身磷酸化，激活丝裂原活化的蛋白激酶，选择性增强EC有丝分裂，刺激EC增殖并促进血管生成；此外，升高血管尤其是微小血管的通透性，为细胞的生长和新生毛细血管网的建立提供营养。最近对VEGF的调控机制研究发现，细胞在低氧含量或某些癌基因产物作用下可产生缺氧诱导因子－1（hypoxia－inducible　factor　1，HIF－1），它是一种转录因子，可明显促进VEGF基因的表达，促进VEGF的生物活性。HIF－1包括120ku的α亚基和91－94ku的β亚基，β亚基与细胞的多种功能有关，而α亚基则仅与O2能量代谢有关，调控的靶基因包括VEGF、促红细胞生成素（Epo）、PDGF、bFGF、NO、内皮素1等，相应的产物协同作用，从而改善缺氧状态。Reyes等发现骨髓来源的间充质干细胞（mesenchymal　stem　cells， MSCs）不仅诱导产生成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等，而且在VEGF－β作用下，还可以向血管母细胞、EC表型分化，表达CD34、CD31、Ⅷ因子等，当然MSCs在体内是否能大量增殖分化为有功能的EC而促进血管生成，尚有待进一步实验证实。

1．材料　hVEGF165基因片段、大肠杆菌DH5α、真核表达载体pcDNA3。质粒提取试剂盒，脂质体（LIPOFECTAMINETM 2000Reagent，LF2000）、DMEM，hVEGF165兔抗人IgG抗体SABC试剂盒，限制性内切酶和连接酶，胎牛血清。2个月龄新西兰大白兔72只购自本校实验动物中心，均为雄性，质量（1．5±0．2）kg。

2．方法　pcDNA3／hVEGF165真核表达载体的构建及鉴定，将hVEGF165插入pcDNA3的EcoR　I和HindⅢ多克隆位点，并转化DH5α进行扩增，采用微柱法提取质粒，然后进行酶切、电泳鉴定，回收VEGF片段，并装入测序载体送上海博亚生物制品公司测序。仍用微柱法提取质粒，乙醇沉淀法纯化质粒，之后用TE溶解，－30℃保存以备转染。pcDNA3／hVEGF165转染骨髓MSCs约24d时，MSCs铺满培养瓶底，用1．25g／L胰酶EDTA液消化，并按1∶3的比例分瓶，20h后再换1次培养液，至24h，各瓶细胞约80%汇片，按LF2000说明书将pcDNA3／hVEGF165 A组、（pcDNA3B组）、转染两瓶。

从血管生成的机制出发，利用生长因子或细胞来促进血管生成这个研究思路早已存在，但血管生成的基础研究进展为其提供了新的措施。首先应进一步完善VEGF的缓释技术，尽量保留VEGF生物活性，在临床应用时，要求能随着血管生成的发生而逐渐降低含量。另外还可探讨其他重要的相关因子的应用，如通过HIF－1来调控相关因子的表达，细胞在缺氧状态下合成的微量HIF－1即可调节VEGF、Epo、bFGF的高表达，从而促进血管生成，当缺氧状态改善后，HIF－1分泌又可逐渐减少。

（二）bFGF在骨髓基质干细胞中的转染

bFGF碱性成纤维细胞生长因子（basicfibroblast　growthfactor，bFGF）是骨和软骨组织中的一种成分，它可以促进成骨细胞和软骨细胞的分裂增殖，在培养中抑制软骨细胞的最终分化。在异位成骨中，bFGF可以通过增加受体床的新生血管形成改善血供条件，并且有助于多能性间充质细胞趋化和增殖。Leunig等通过实验研究bFGF的作用，在体外，bFGF抑制软骨细胞的分化，降低软骨板的生长速度，但是在鼠皮下植入的体内实验中，bFGF通过促进血管化加快新骨的形成，这也从另一方面说明了血管化对新骨形成的作用。

1．材料　含有bFGF全长cDNA的克隆载体puc13－rbFG，pcDNA3－bFGF重组表达载体由我科自行构建；脂质体（Lipofectamine）、G418、型胶原酶、胎牛血清（FBS），碱性磷酸酶（ALP）检测试剂盒；骨钙素（OC）放免检测试剂盒。

2．bFGF基因转染MSCs的瞬时及稳定表达检测　取2个月龄新西兰大耳白兔2只，无菌条件下取胫、股骨骨膜，先后以0．25%胰酶及0．1%I型胶原酶各消化30min及2h，离心收集细胞，置于37℃5% CO2培养箱培养，培养基为DMEM，含有10%FBS、10－7　M地塞米松、50mg／L维生素C、青霉素100U／ml、链霉素100μg／ml。将1×105／ml原代MSCs接种于6孔培养板，各孔内均预置盖玻片一块，当细胞生长至70%～80%融合时，按标准方法以5μl脂质体介导2μg　pcDNA3－bFGF重组表达质粒转入MSCs，为实验组。对照组仅转入2μg pcDNA3空载体。48h后各组取出2孔细胞爬片，检测瞬时表达情况。其余各孔用G418筛选（表达载体中含ne－or抗性基因），2周后抗性克隆形成，更换为含20% FCS的DMEM扩大培养2周，取出各组细胞爬片检测稳定表达情况。瞬时及稳定表达检测用免疫组化SABC法，I抗为兔抗小鼠bFGFMcAb，阴性对照为未加I抗之正常细胞。

（三）BMP在骨髓基质干细胞中的转染

关于BMP的促血管形成作用有争议，Suwa等认为，BMP加入到HAP中可以显著地刺激新血管形成，逐渐形成丰富的血管网包裹HAP，加速骨缺损的愈合，而且HA复合BMP可以显著刺激未分化的间充质细胞分化为成血管内皮细胞和成骨细胞。但是Levine和Yamashita等认为，BMP对血管形成只有轻微或没有作用。

1．材料　含hbMP－7全长cDNA质粒PBSK－hBMP7（American　Tissue　Culture Collection）；PLNCX2反转录病毒载体和PT67包装细胞（Gene　Company）；限制性内切酶Sal　I、Sma　I、T4连接酶（New　England Biolab）；FuGenetm6（脂质体转染试剂，Promaga）；SuperScript　One－Step　RT－PCR试剂盒（Life　Technologies）；Hbmp－7抗体（Santa　Cruz）；Hbmp－7原位杂交试剂盒。

2．方法

（1）Hbmp－7反转录病毒载体的构建Hbmp－7基因的鉴定，BPSK－hBMP7含有Hbmp－7Cdna，全长1　448bp。使用Sal　I酶切PBSK－hBMP7，琼脂糖电泳观察片段大小。

（2）PLNCX2－BMP7反转录病毒表达载体的构建和鉴定，小量制备PBSK－hBMP7和PLNCX2质粒—Sal　I酶切—凝胶片段回收—PLNCX2回收片段进行CIP处理—T4连接酶连接BMP7基因和PLNCX2载体—转化大肠杆菌DH5α感受态细胞—提取质粒进行酶切鉴定（Sma　I酶切）—筛选出正确插入的重组质粒PLNCX2－BMP7。采用Sanger法进行测序，与Genebank中基因序列进行对比。

（3）DNA的转染与包装及重组病毒液的制备，在转染前1天，选择生长状态良好的PT67细胞，按1×105接种在6孔板中。小量提取PLNCX2－BMP7和PLNCX2，使用FuGENETM6转染，待细胞形成50%～80%汇合的单层后，按1∶3传代，使用G418筛选至阳性克隆形成，将阳性克隆细胞进行扩增，待细胞形成50%～80%汇合的单层后按1∶3传代，使用不含G418的培养基培养48h，收集培养基上清，命名为PT－PLNCX2－BMP7和PT－PLNCX2。

（4）病毒滴度的测定，在测定开始前1d将NIH3T3细胞以5×104～105／孔密度种于6孔板中，从包装细胞中收集含病毒的培养基。用0．45μm硝酸纤维素膜过滤，分10－1～10－5个稀释梯度感染NIH3T3细胞，对细胞进行传代并使用G418进行抗性筛选4周。经筛选的细胞可逐渐形成克隆，统计细胞克隆数，计算病毒滴度。

（5）BMP－7反转录病毒液感染BMSc，感染前12～18h以1．5×105密度将BMSc种于6孔板中。细胞分组为PT－PLNCX2－BMP7转染组、PT－PLNCX2转染组、未转染组。按滴度较高的稀释倍数将PLNCX2－BMP7和PLNCX2病毒液加入BMSc中，培养24h后更换培养基。细胞继续培养48h后进行短暂表达检测。同时使用G418筛选细胞至阳性克隆形成（约2周），将阳性克隆细胞进行扩增，约2周后细胞形成50%～80%汇合的单层，传代进行稳定表达检测。

（四）细胞因子的缓释系统

所谓载体及缓释系统，是指细胞因子与之结合后植入体内时，可使细胞因子继续保持其成骨活性，并因作用时间更持久。缓释促血管形成生长因子的作用与其他局部应用的调节因子一样，在使用的过程中应该保持足够的局部浓度和作用时间，并且释放平稳。因此促血管形成的生长因子的局部缓释使用应该是最好的选择。El－cin等用壳聚糖－白蛋白微球作为载体制作ECGF缓释剂，在体外3周时仍可保持（0．5wt%）／d的平稳释放，植入大鼠腹股沟区7d后有大量的新生血管形成，对照组（直接注射ECGF）在同等时间无明显新生血管形成。生长因子也可以通过基因转染技术，将促使血管的生长因子转入种子细胞，使种子细胞能持续地自动产生高效能的生长因子。

目前研究较多的细胞因子缓释系统有以下几类。

1．无机盐类　20世纪70年代以来，国内外相继研制出了与人体硬组织无机成分及结构相似的生物活性磷酸钙陶瓷（calciumphosphateceremic，CPC），它具有传导性成骨作用，在材料－受体骨界面间可形成骨连接。目前已作为骨替代物用于多科临床。这类材料包括生物活性玻璃（bioactiveglassceramic，BGC）、磷酸三钙（tricalciumphosphateceramic，TCPC）和双相磷酸钙（biphasecalciumphosphate，BCP）等。磷酸钙骨水泥（calciumphorphatebonece－ments，CPBCs）在骨缺损修复的研究领域，由于羟基磷灰石陶瓷（hydroxyapatietceramic，HAC）具有很好的生物相容性，不会引起炎症及受体区周围细胞的毒性反应，特别是它具有传导成骨活性而能与受体骨发生直接的骨结合，问世以来受到了广大临床医生的关注。但无论是颗粒型或大块型的HAC，因为均是陶瓷结构，故其本身有难以克服的缺陷：大块型难以塑形，外观不能达到美容效果；材料难于和骨缺损缘密切接触，不利于界面间传导性生成新骨；颗粒型则由于缺乏形态稳定性，不但难保持所要求的形状，而且易于滑出，使HAC的应用受到了很大限制。加以HAC较难降解吸收，将成为长期植入体内的异物而存留。由于磷酸钙骨水泥的问世，使上述陶瓷结构的问题得到了相应的解决。Brown和Chone首先研制出的CPBCs不属陶瓷类，可以不预先成形，可以膏状物置入缺损处而后在体内固化，最终转化为HA等磷酸盐晶体。由于CPBCs固化后可形成微孔结构，并且能够体内降解吸收，目前很多研究把它当作一些药物或生物活性因子的载体和缓释系统。Yu等用CP－BCs与头孢氨苄和诺氟沙星混合制成小丸，体外观察药物的释放行为，发现上述药物与CPBCs的混合不影响后者的固化过程，药物在PBS缓冲液中的释放遵守Higuchi方程式，提示药物是通过扩散的方式从CPBCs中释放出来的。Hamanishi等在CPBCs作为万古霉素的载体释放系统的研究中发现，含有1%万古霉素的CPBCs，万古霉素PBS缓冲液中的有效释放可持续2周，当万古霉素量增加到5%时，则可持续达9周以上。含有5%万古霉素的CPBCs植入骨组织3周后，骨中的万古霉素平均浓度高达其最低抑菌浓度的20倍。

2．有机载体　胶原（collagen）胶原是利用胃蛋白酶从猪皮中提取的有机成分，无明显抗原性，可降解吸收。脱钙骨基质（DBM）脱钙骨基质为多孔三维结构的细胞因子载体，低免疫原性，可在体内降解吸收。纤维蛋白凝块（fibrinclot，FC）或成纤维蛋白黏合剂（fibrinsealant，FS）应用人纤维蛋白原，在凝血酶、X　a、Ca2＋等的共同作用下，通过肽腱交叉连接，可形成牢固的FC。FC有很强的吸附能力，临床上用于止血修复肝脾破裂时，称为FS。由于FS抗原性甚微，可完全被吸收，所以作为BMP载体和缓释系统，值得更深入地研究。

二、多种细胞联合移植

血管化和细胞在骨的生长和改建中有一个复杂的通讯网络起作用，其中包括有内皮细胞、成骨细胞、破骨细胞、巨噬细胞、基质细胞等，通过这个网络传导全身系统信号和局部信号，对生理变化起反应。骨的微血管在这个过程中起中枢的作用，调节骨细胞的生理反应。

在组织工程化骨的构建中，血管内皮细胞和成骨细胞的联合培养优于成骨细胞的单独培养。实验证明，成骨细胞和内皮细胞间共同培养时，在细胞的调控和功能上相互促进，这是因为细胞有旁分泌作用。Villars等把成骨前体细胞（人骨髓基质细胞：HBMSE）单独培养或者和内皮细胞（人脐静脉细胞：HUVEC）按不同的方式混合培养（直接或非直接接触），实验表明，HBMSC合成和表达VEGF对HU－VEC培养起促进作用，并且当HBMSC和HUVEC直接接触培养时ALP的活性提高，这表明两种细胞间不仅存在着分泌的细胞因子的相互作用，还涉及细胞膜蛋白的细胞间通讯的直接作用。Wang等报道，ALP阳性人成骨细胞和ALP阴性人脐静脉血管内皮细胞按1∶1比例间接共培养时：成骨细胞可持续表达VEGF　mRNA，并可通过产生VEGF刺激内皮细胞增殖；而活化的内皮细胞通过产生成骨因子如胰岛素生长因子和ET－1等增加骨细胞增殖、分化。在成骨细胞细胞膜表面存在ET－1受体，ET－1通过与其受体结合从而提高成骨细胞ALP活性和3　H－脯氨酸掺入。余希杰等用人胚骨膜成骨细胞和人脐静脉血管内皮细胞按1∶1直接和间接培养发现：两种培养方法均能增加成骨细胞的增殖和ALP活性，间接培养作用强于直接培养。Frerich等将骨髓基质细胞在体外扩增，种植到微载体上。将微载体置入含内皮细胞的纤维基质上，在体外培养。6周后显示毛细血管样结构增加到140mm／mm3。进一步的试验表明，高压氧可以明显增加毛细血管样结构的形成。

新生血管需要内皮细胞生长，内皮细胞可取自血管的内皮，也可以由骨髓基质细胞分化而来。Hat－tori等在鼠的骨髓基质中培养出内皮细胞，用RT－PCR方法验证了存在VEGF的受体VEGFR－1，2、Tie－1，2和von－Willebrandfactor（冯·威利布兰德因子，VWF），并且转导入ts－SV40T－antigen基因形成了永生化内皮细胞系。骨髓基质细胞含有数种前体细胞，能分化成内皮细胞，并且能分泌促血管生长因子，如VEGF、bFGF，在大鼠的角膜模型中植入骨髓基质细胞可见血管形成。用骨髓基质细胞分离、培养内皮细胞和促进血管形成的效果是肯定的。目前，已经有人用直接注射自体骨髓基质细胞的方法治疗心肌缺血，并且已经进入临床试验阶段。由此考虑，在骨组织工程的种子细胞的选择上，利用骨髓基质细胞，使之定向分化为成骨细胞和内皮细胞，并使二者相互促进发挥作用，可能是一个有前景的研究方向。

（一）兔骨膜成骨细胞（rabbit　periosteal osteoblasts，RPOB）与肾血管内皮细胞（rabbit renal　vascular　endothelial　cells，RRVEC）间接共培养

1．细胞获得和培养　取2周龄健康新西兰兔4只，雌雄不限，体重（150±20）g，戊巴比妥钠30mg／kg行耳静脉注射麻醉后静脉空气栓塞处死。无菌条件下切取双后肢胫骨前内侧面骨外膜及双侧肾脏。

2．RPOB的培养　将骨膜立即投入到DHank’s液中漂洗3次去除血污。0．1%胶原酶5ml消化1h（37℃），离心（1　200r／min）后去上清液，D－Hank’s液洗2次，再用0．1%EDTA与0．25%胰蛋白酶等量混合液5ml消化3min（37℃），加入20%小牛血清2ml终止消化，离心（1　200r／min）后去上清液，用DHank’s液洗2次备用。将细胞分别接种于2个含F12培养液（内含10%小牛血清，青霉素6mg／L，链霉素0．1g／L）的培养瓶中，于37℃，5%CO2孵箱培养48h后，观察生长情况。如有细胞贴壁生长为细胞存活。传至5～7代待用。

3．RRVEC的培养　无菌条件下将肾脏放入盛有D－Hank’s的瓶皿中洗涤3次，去除被膜及肾盂等结缔组织，将肾皮质移入无菌青霉素小瓶中。用眼科剪充分剪碎后用0．25%的胰蛋白酶37℃，5%CO2孵箱中消化30～40min，取出加2ml培养基终止消化，离心（1　200r／min）5min，弃上清液，加入20%F12培养液充分吹打后移入培养瓶37℃，5%CO2孵箱培养，48h后观察细胞贴壁，换液。传至3～4代待用。

4RPOB和RRVEC的间接共培养方法：将消化离心所得RPOB和RRVEC用F12分别调成细胞密度为2×105个／ml的悬液。对照组及试验1、2、3组均分别设为4个孔，每孔均种植RPOB细胞悬液1ml及F12培养液2ml。所有培养孔上方均放置细胞嵌盒，对照组细胞嵌盒内为2ml单纯F12培养液；试验1、2、3组的细胞嵌盒内分别为RRVEC细胞悬液0．5ml及F12培养液1．5ml、RRVEC细胞悬液1ml及F12培养液1ml、RRVEC细胞悬液2ml；即试验1、2、3组RPOB和RRVEC间接共培养比例分别为2∶1、1∶1及1∶2。四组细胞嵌盒底部充分浸入RPOB培养液，通过嵌盒底部透明膜，RPOB和RRVEC分泌的各种因子可以自由流动。

（二）内皮细胞和平滑肌细胞的原代培养及联合培养模型

人工材料血管移植技术始于20世纪50年代，困扰该技术临床应用的关键是因为缺少内皮单层而导致的血栓和钙化形成以及植入手术吻合端平滑肌细胞的增生所致的血管堵塞。生理状态下血管内皮细胞不仅是防止血栓和钙化形成的天然屏障，还与平滑肌细胞之间在形态结构和功能等方面相互影响。有人将培养的内皮细胞种植于人工血管的表面，欲使其产生与体内相似的抗凝血功能。结果，种植了内皮细胞的人工材料表面较单纯人工材料表面血栓形成率确实大大下降。研究表明，内皮细胞的形态结构、功能活性与其所处的体内微环境（流体动力、细胞外基质、周细胞、神经体液因素）有关。若在种植的内皮细胞中加入其所处微环境中的调控因子，则使其更接近于生理状态。平滑肌细胞是内皮细胞的周细胞之一。在体内两者隔以细胞外基质相邻，而基质中含有内皮细胞和平滑肌细胞各自分泌的物质，基质中除具有基本的结构元素（纤维、非纤维胶原、糖蛋白）外，还有细胞分泌的许多生长因子、分化因子、调节信号因子，基质就是通过这些因子影响着细胞的分化和功能特异性。以往的研究初步证实，与单独培养的内皮细胞相比，联合培养体系中内皮细胞的黏附能力增加，生存时限延长，形态结构发生的变化使其抗应变能力增强，无疑这些结果将增强人工种植内皮细胞的功能特性，使有利于在移植物表面形成理想的内皮单层，从而为内皮细胞人工种植技术的应用带来新的突破。

培养方法：内皮细胞和平滑肌细胞的原代培养及联合培养模型的建立新生小牛胸主动脉5～10cm，去除外膜，用0．1%胶原酶和0．125%胰酶的混合液（1∶4）消化，收集消化液将细胞以5×104个／ml浓度种植于培养瓶中。将上述血管的中膜剪成1mm×1mm的小块，置于胰蛋白酶中消化，细胞悬液用含血清培养基稀释并种植于培养瓶中，2～3d换液1次。传代至2～10代的平滑肌细胞经胰酶消化，调整细胞浓度到5×104个／ml，种植于PET膜的外面，12h后细胞贴壁完全，将膜翻转，在膜的内面以同样的浓度种植2～10代的内皮细胞，然后将PET膜插入配套的6孔培养板中，进行联合培养，观察到细胞贴壁时为长三角形或长梭形，即为模型建立成功。

三、显微外科技术的应用

体外培养构建的组织工程化骨组织复合物植入体内后，即由血液－细胞间液完成细胞的营养供应，脱离了体外培养环境的种子细胞在缺乏足够的营养时，其增殖、分化、分泌功能必将受到影响甚至死亡，造成成骨能力下降。因此，尽早建立血运才能保留复合物的成骨优势，同时促进血管化的过程还可带入更多的成骨细胞因子，也可进一步促进骨组织的早期快速再生。在体外构建的组织工程化组织是细胞与材料的复合体，本身没有营养来源，体内植入后，小组织可通过周围组织血管长入，使其逐渐与周围组织建立血液循环并获得营养。若受植区血循环不良，植入物建立血管化过程延长，则复合的细胞由于缺乏营养，不能进行正常的新陈代谢，将影响细胞的增殖、分化及分泌功能，甚至死亡，导致移植物失效而成为异物。在大块组织工程化组织，如长段组织工程化骨组织，由于其形态常须制作成管状，有一定的直径及长度，依靠周围组织血管长入则速度太慢，所需时间较长且很难使长入的血管达到管状组织工程骨的内层，在尚未建立新的血循环之前，复合在材料上的成骨细胞已死亡。因此需研究长管状组织工程化骨的快速建立血管化的技术。组织工程化组织的血管化研究与显微移植技术，是显微组织工程研究十分重要的课题，已充分显示了显微外科技术在组织工程研究中的重要地位。由于组织工程学研究的历史较短，显微外科技术在组织工程学研究中的应用才刚刚起步。随着组织工程学研究的深入发展，显微外科技术的应用将会不断深化组织工程学的研究，同时也会在将来组织工程化骨组织临床移植中发挥更加重要的作用。

（一）组织工程化骨组织再血管化中血管束植入术应用的实验研究

将血管束植入骨缺损处促进成骨的作用机制是靠植入血管与骨缺损处的血肿机化形成毛细血管网，以新的循环路径促进骨再生，并也依赖于骨缺损两端的成骨细胞的增殖，使血肿机化的血管束启动成骨。矢岛弘嗣等报道，将狗的血管束移位植入胫骨骨髓腔内及骨膜上，1～5周后已有血管互相沟通。平濑雄一报道将大白鼠的隐动、静脉血管束植入胫骨段中，然后移位于小腿肌肉内，10周后移位于腹部皮下，发现血管长入骨皮质中与周围血管沟通血循环；部分哈佛管内有荧光物质的摄取；10周时约50%的骨陷窝内骨细胞存活，骨膜有成骨作用。Alam等将硅树脂制成下颌骨形状，从中间剖开，装载骨基质材料和rhBMP－2，植入鼠的大腿内侧，将包含隐静脉的肌蒂夹在材料中。4周后可形成外形和下颌骨一样的带血管蒂的肌骨瓣，组织学显示材料内新骨形成，有丰富的血管网。

由此可见血管束植入术对移植骨再血管化的重要作用。我们在组织工程骨组织构建中也使用了血管束植入技术。在我们的实验中使用中空的聚乳酸和磷酸三钙复合材料复合骨髓基质细胞用以修复胫骨中段3cm长的骨缺损，我们将胫前动静脉及其周围结缔组织全程贯穿于中空的复合材料。术后通过X线及组织学切片进行观察，从初步的实验结果来看，至少血管束植入组在成骨量上要高于未植入组，鉴于在成骨过程中一般情况下成骨量和再血管化的程度是成正比的，我们预计，血管束植入组再血管化的程度应该优于未植入组，这还须进一步的观察。由此可以看出血管植入的方法在骨组织工程技术中有着非常好的前景（图9－8，彩图22）。

图9－8　血管束植入组织工程骨内

（二）以带血供肌瓣为BMP载体修复骨缺损的实验研究

1．带血供肌瓣为BMP载体修复骨缺损的能力　制作兔桡骨下段15mm骨缺损，将指深屈肌肌瓣去神经后，转位至缺损区，作为BMP载体来修复骨缺损。经大体、X线、组织学、生物力学检测，利用这种方法可软骨内成骨过程形成生物学特性良好的骨缺损，从而修复骨缺损。

2．带血供肌瓣作为BMP载体修复骨缺损成骨过程中骨骼肌的转归　通过大体观察、组织学、原位末端标记（TUNEL）及电镜等方法观察：骨骼肌逐渐发生萎缩，8周时肌纤维几乎完全消失；组织学显示骨骼肌萎缩的同时，部分细胞核出现崩解，并有凋亡小体出现；TUNEL染色呈阳性；电镜观察显示骨骼肌肌丝随时间延长逐渐消失，细胞核出现染色质边集、固缩、碎裂，呈典型的凋亡改变。说明带血供肌瓣复合BMP修复骨缺损成骨过程中，肌纤维逐渐发生萎缩、凋亡，最终被骨组织所替代。

3．BMP对骨骼肌卫星细胞（SMSc）生物学特性的影响　Ⅰ型胶原酶与胰蛋白酶二步消化法获取细胞，差速贴壁法进行纯化，经α－sarcometric　actin和myosin免疫组化染色鉴定所得细胞具有成肌能力，为SMSc。利用BMP作用体外培养的SMSc后，MTT法检测细胞增殖速度加快；HE染色显示细胞融合率降低；RT－PCR方法检测成骨细胞特异性蛋白Ⅰ型胶原、骨钙素、骨涎蛋白在mRNA水平的表达增高；3　H－脯氨酸掺入法测定Ⅰ型胶原，试剂盒测定ALP活性，放射性免疫法测定骨钙素、层粘连蛋白含量，标明这些骨特异性标志物在蛋白水平的表达增高。说明BMP可抑制SMSc的成肌分化，而诱导其分化为成骨细胞。

以带血供肌瓣作为BMP载体修复骨缺损动物实验初步获得成功，预示着肌肉组织在修复肌肉、神经缺损的基础上又具有骨修复的能力。这种方法尤其适用于局部软组织情况差而血运不好的难治性骨缺损，对于骨缺损伴有皮肤缺损或皮肤瘢痕形成，可采用肌皮瓣移植，在肌瓣修复骨缺损的同时利用其表面的皮瓣一期修复皮肤缺损，从而大大缩短病程，提高手术疗效。同时，本实验也证实可通过反转录病毒载体将BMP基因转染入带血供肌瓣内，通过在具有长期、稳定、有效地表达BMP来发挥更好的骨缺损修复效果。此方法扩大了肌瓣的应用范围，给传统的肌瓣移植术赋予了新的内涵，同时也丰富了显微外科的内容，是骨缺损治疗观念上的更新。

（三）组织工程化骨组织再血管化中筋膜瓣包裹术应用的实验研究

早在1918年Gillies和Esser就认识到深筋膜对皮肤血流的重要性。通过新鲜尸体血管染料灌注和动物实验观察，也可发现深筋膜血管网相当丰富，不带皮桥的筋膜蒂岛状皮瓣，转移不影响存活的长度，蒂的位置不受动脉血流方向的限制，设计灵活性较大。因此，在显微外科临床工作中，常采用带蒂筋膜组织包裹或大网膜包裹缺血组织，使其建立血循环，这项技术对组织工程化骨再血管化提供了一个非常切实可行的方案。在我们的实验中，在羊小腿中段制造一个随意深筋膜瓣的实验动物模型，用该瓣包裹复合了经扩增的骨髓基质细胞的生物材料，以修复羊胫骨中段2cm的骨缺损并以钢板螺钉内固定。术后以放射性核素骨显像，动态观察组织工程化骨在体内再血管化的进程，我们发现在术后直至第8周筋膜包裹组比未加筋膜包裹组在放射性核素浓聚灶的浓度和面积上有明显的优势。显示出筋膜瓣包裹对组织工程化骨再血管化的进程有着明显的促进作用。同时术后CT横断面结果显示，筋膜瓣组所成骨之中心未见骨坏死或空隙状未成骨区，在组织学切片上筋膜瓣包裹组在血管的数量及质量上也都有明显的优势。传统的观念认为筋膜瓣包裹自体移植骨后血管由外部长入只能达到3mm左右，而我们则通过实验发现实际距离可能要远远超过这个数字，这也可能是因为我们实验中筋膜瓣所包裹的是有生命力的组织工程化骨，本身就有自主成骨及诱导血管再生的能力，所以显示出两者结合后的相互促进的优势（图9－9，彩图23）。

图9－9　筋膜瓣包裹组织工程骨

（四）组织工程化预构骨瓣的临床应用价值

众所周知，带有血运的骨移植比传统的骨移植修复骨缺损具有明显的优势。不带血运的骨移植只有诱导成骨作用，使移植骨的吸收和新骨生成同时发生，只能起到“同步取代”的作用。而带血管蒂的骨瓣移植，可以完整的对合两端填补在骨缺损处（如吻合血管腓骨移植修复股骨缺损），带血管蒂的骨瓣移植由于保证了骨的主要血液供应，移植后骨细胞及成骨细胞等组织细胞全部存活或大部分存活，其愈合过程类似于双极骨折（bifocalfracture）的愈合过程。这种修复是快捷的，已成为共识。受此启发，在组织工程骨的构建过程中为能达到带血管蒂的组织工程骨的局部转移或吻合血管游离移植修复骨缺损，我们也开始尝试将生物材料细胞复合体预先置于各种带蒂的筋膜瓣及肌瓣中，待其完成成骨及再血管化过程后再行移植。希望能够通过这一技术达到理想的效果。

（五）利用显微制造技术和计算机辅助设计、计算机辅助制造技术（CAD／CAM）

在体外合成血管化组织是组织工程的一个新的发展方向。CarnegieMellon大学正在进行这方面的研究。其基本原理是利用显微制造技术在薄膜材料上根据组织特异性构建出相应的材料结构，如毛细血管的沟槽和骨小梁结构，再种上相应的细胞，如血管内皮细胞和成骨细胞，然后将多层薄膜层叠固定，制造出含血管网的骨组织。目前这方面的技术已经在肝脏的组织工程制造血管网的试验中加以应用。

目前有关组织工程化新生骨组织中血液供应重建的研究报道不多，究竟采用何种方法能取得最佳的修复效果还不确定，需要更多的实验来证实。而将显微外科技术应用于血管化组织工程新生骨组织的构建有可能会取得更好的效果，并且可以通过局部转移和吻合血管的方法，将血管化的组织工程新生骨组织应用于邻近或远隔部位的骨缺损修复，使之更适合临床应用的需要。因此，组织工程化骨组织的再血管化研究是显微外科技术与组织工程技术相结合中重要研究课题，这也充分显示了显微外科技术在组织工程研究中的重要地位。