肿瘤培养基基础知识

补充实验_病毒生物实验

补充实验

实验二十三　血细胞凝集抑制试验

一、实验目的

掌握血凝抑制试验的方法及其应用。

二、实验原理

流感病毒的血凝性，可被免疫血清中的特异性抗体所抑制，使其失去凝集作用，借此可用已知抗体鉴定未知病毒及病毒的型、亚型。

三、实验材料与器材

(1)流感病毒型与亚型免疫血清。

(2)1%鸡红血球、0.85%生理盐水。

(3)血凝板、吸管、三角瓶。

四、实验方法和步骤

(1)血凝板中每孔加入0.25ml生理盐水(10孔)。

(2)取制备的鼠抗血清做1∶10稀释，并加入到第一孔中，吹打3次，混匀后取0.25ml加至第2管，并依次做倍比稀释，至第8管为止，第9管为病毒对照，第10管为血清对照。

(3)每管加入流感病毒悬液(每0.25ml含4个血凝单位)，第10管不加病毒液。37℃处理2h。

(4)摇匀后每管加入0.5%鸡红细胞0.5ml，置室温30min、45min各观察一次结果，以45min的结果为准(如果红细胞滑下，参考30min的结果)。

(5)观察血凝的判断标准同血凝试验，但本试验是以不出现血凝现象的试验管为阳性，凡呈现完全抑制凝集的试管中，其血清的最高稀释度作为血凝抑制效价。

血凝抑制效价:完全抑制红细胞凝集的血清最高稀释度，即该血清的抑制效价。

鉴定病毒时，效价应与原免疫血清效价相等或相似，血凝抑制试验亦可用已知病毒抗原测定病人血清抗体以进行血清学诊断，恢复期比初期抗体效价增高4倍以上才有诊断意义。

五、方法评注

在正常动物的血清中都存在有非特异性的血凝抑制因子，这就影响了血凝抑制试验的结果。为此，在血凝抑制试验之前，必须将血清经过处理，除去血清非特异性血凝抑制因子，血清(被检、阳性、阴性)处理有白陶土法和冷丙酮法两种:

①冷丙酮法:被检血清的处理→被检血清0.2ml→加冷丙酮4ml→塞紧振荡55min→离心3000r/min，5min→弃上清液，抽气干燥1h→加pH9.0BHS2ml→振荡溶解后→56℃灭活30min→加8%红血球0.05ml→混匀放37℃水浴30min→300r/min离心10min，上清液即为待检血清。

②白陶土法:被检血清的处理→被检血清0.1ml→加25%白陶土0.5ml→振荡混匀置37℃1h→加pH9.0BHS液0.5ml→混匀→6000r/min离心5min→56℃灭活30min→加8%红血球0.05ml→混匀放37℃水浴30min→300r/min离心10min，上清液即为待检血清。

实验二十四　传代细胞培养

一、实验目的

掌握传代细胞培养的原理和方法。

二、实验原理

在适宜的条件下细胞生长到一定的阶段就分裂成新的细胞，细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代(再培养)。

传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法，同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。

传代细胞即是利用活细胞在适宜条件下繁殖的特性，进行细胞的扩大培养。

三、实验材料与器材

(1)Hela细胞系。

(2)0.2% EDTA溶液(无钙、镁离子的PBS配制)、68.95kPa蒸汽灭菌(115℃)10min。

(3)1万单位/ml青霉素、链霉素。

(4)1640培养基、新生小牛血清。

(5)7.5%NaHCO₃真空抽滤除菌。

(6)无菌培养瓶及瓶塞、无菌10ml吸管及吸耳球、无菌100ml三角瓶(盛培养基用)、烧杯、无菌试管。

四、实验方法和步骤

1.培养基的配制

(1)1640培养基(RPMI)一包于2000ml三角瓶中，加入950ml双蒸水充分摇匀使1640溶解，定容至1000ml。

(2)将溶解后的1640抽滤除菌，分装于100ml培养瓶(或三角瓶)中，每瓶90ml。

(3)除菌后的1640培养基，每100ml培养基中加入已灭菌的7.5% NaHCO₃1～2ml，使培养基呈紫色，然后加入1ml双抗和10ml小牛血清，塞紧橡皮塞后置4℃保存备用。

2.细胞的消化

(1)取一大瓶已长成致密单层的Hela细胞，倒掉生长液，然后每瓶加入0.02%胰酶2～3ml，塞紧瓶塞，37℃保温10～15min。

(2)在倒置显微镜看到细胞成分散小球状，表明此细胞已消化好，轻轻将培养瓶翻转。

3.细胞传代

(1)将已消化好的培养瓶中的EDTA倒掉，每瓶中加入35ml细胞培养基，塞紧橡皮塞，使劲摇晃，使细胞从瓶上脱落下来。

(2)取30个已灭菌的青瓶，将以消化分散的培养瓶内的细胞悬液分装于其内，每瓶1ml，这样一大瓶细胞传至30个青瓶，塞紧瓶塞，搁置于细胞培养盘中，放好，避免滚动，上面画线标记。

(3)37℃培养24h。

4.结果

显微镜下观察并记录结果。

五、方法评注

传代细胞是可在体外连续传代的细胞系，理论上具有无限传代的寿命。传代细胞系可以通过以下方法获得:①人或动物肿瘤细胞的原代细胞的系列培养，例如Hela细胞、Namalva细胞等;②携带致癌基因的病毒，将致癌基因转化给正常细胞，成为肿瘤细胞，例如EB病毒转化的B淋巴细胞;③骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合，例如生产单克隆抗体的杂交瘤细胞株;④正常细胞群的连续传代，繁衍成一个新的具有无限寿命的细胞群，例如非洲绿猴肾细胞的传代细胞系Vero细胞、幼仔地鼠肾的传代细胞系BHK21细胞、中华仓鼠卵巢细胞的传代细胞系(CHO细胞)等。

传代细胞有能够充分鉴定和标准化;使用细胞种子库系统生产，有利于质量控制;可用于微载体生物反应器，可大规模生产;对培养基及牛血清的营养成分要求不高等优点，但由于传代细胞理论上有致肿瘤性的危险，目前尚无用于疫苗生产的来源于人类组织的传代细胞系。目前用于疫苗生产的传代细胞主要是Vero细胞。WHO认为Vero细胞在150代以内使用是安全的，无致肿瘤性。

例如，人用狂犬病纯化疫苗、脊髓灰质炎灭活(纯化)、肾综合征出血热纯化疫苗、乙型脑炎纯化疫苗均已使用Vero细胞生产。

实验二十五　病毒TCID50测定

一、实验目的

掌握TCID₅₀测定的原理、试验方法、分析结果和计算。

二、实验原理

TCID₅₀及半数培养感染剂量(50% tissue culture infective dose)，以使50%的试验培养细胞出现感染反应的病毒稀释液的稀释度倒数的对数值来表示。多数病毒感染体外培养的细胞后，常引起细胞形态学改变，如细胞团缩、裂解和细胞肿大等，这种改变称为病毒致病变效应(cytopathic effect，CPE)，可以直接通过显微镜观察，亦可通过染色识别和判断。CPE的程度可间接反映病毒的毒力，因此利用这种特征可以测定病毒的毒力。

它所测定的不是病毒颗粒的数目，而是病毒感染反应的有或无，严格说来是一种定性测定法。但是因为感染反应的有或无与病毒颗粒数目之间有一定定量关系，且该法灵敏度高，重复性好，所以仍广泛用于病毒的定量测定，特别是应用于某些病毒的试验诊断及病毒毒力和宿主抗性的定量分析。

在从事药物的抗病毒试验中，常用100 TCID₅₀的病毒感染量进行。

测定时，首先在微量细胞板上培养敏感细胞，待细胞贴壁形成单层时，弃上清液。将待测病毒用维持液做连续10倍系列稀释后加入细胞单层，逐日观察，直至病毒产生的CPE不再进展为止。具体时间根据病毒的增殖特点而定，如肠道病毒增殖迅速，一般48h即可;RSV、VSV增殖也较快，因此48～72h也可以观察、染色、计算。

三、实验材料

(1)Hela细胞系。

(2)0.2% EDTA溶液(无钙、镁离子的PBS配制)，68.95kPa蒸汽灭菌(115℃)10min。

(3)1万单位/ml青霉素、链霉素。

(4)1640培养基、新生小牛血清。

(5)7.5%NaHCO₃真空抽滤除菌。

(6)脊椎灰质炎病毒Ⅰ型(疫苗株)。

(7)稀释液同细胞维持液。

(8)细胞生长液:1640+10%新生小牛血清。

(9)细胞维持液:1640+2%新生小牛血清。

(10)无菌青瓶及瓶塞、无菌10ml吸管及吸耳球、无菌100ml三角瓶(盛培养基用)、烧杯、无菌试管。

四、实验方法和步骤

1.单层细胞制备

Hela细胞于青瓶中37℃培养24h，待生成单层后备用。

2.病毒液稀释

病毒液作10倍稀释，先将稀释液分装于10个试管中，每管0.9ml，取0.1ml病毒悬液加入第一管中，摇匀后为10^－1，换一支吸管，在10^－1病毒液中吸放3～4次，取0.1ml放入第二管中摇匀后为10^－2…….如此稀释至10^－10。

3.病毒接种

将40个已长好细胞单层的青瓶中的培养液倒掉，取上面已稀释好的病毒液接种于细胞单层，每瓶0.1ml，10^－3～10^－10每个稀释度分别接种4瓶，另取病毒原液接种4瓶细胞，每瓶0.1ml，作为病毒对照。再取4瓶细胞分别接种0.1ml培养基作为正常细胞对照。接种完毕后一起放入37℃温箱内，吸附1～1.5h。

4.结果观察

吸附完毕后倒掉病毒液或稀释液，每瓶细胞中各加入1ml细胞维持液。置37℃培养，24h后观察结果，并按下表记录结果。观察时先看正常细胞对照，然后看试验瓶细胞。

5.实验结果的分析与计算

(1)实验结果列表如下:

(2)计算

根据Reed-Muench公式

半数效应剂量(LD₅₀，ID₅₀或TCID₅₀等)=50%感染的高临界稀释度倒数的对数+距离比×稀释系数的对数

该病毒样品的TCID₅₀效价为10^－5.5。

实验二十六　鸡胚原代细胞的培养

一、实验目的

掌握鸡胚原代细胞培养操作的基本程序，观察单层细胞的生长情况。

二、实验原理

原代培养(primary culture)是细胞从活体中(in vivo)转入离体状态下(in vitro)培养的起始步骤，通俗地说，就是第一次培养。原代培养物的优点在于:细胞刚从活体移植到离体条件下，主要的性状、结构尚未发生改变，仍为二倍体细胞，与细胞系特别是永久细胞系相比，更能反映细胞在活体中的状态。在相对稳定的条件下，用原代培养物做药物测试、细胞分化等实验效果更好。因此，原代培养是组织与细胞培养工作中必须掌握的基础技术。

原代培养的目的是为了使体内细胞适应体外培养环境，从而为我们提供能够在体外连续生长的细胞系(株)。原代细胞培养物可以通过以下途径获得:

(1)组织小块培养法(也称为植块培养)，直接培养组织小块，成活的组织小块在培养过程中会在周围迁移出新生的细胞。

(2)分散法:用机械的、化学的或酶解的方法解离组织块得到分散的细胞悬液，悬液中细胞在培养液中会附着到基质上，从而进一步生长与增殖。

原代培养包括取材、培养材料的制备、接种和培养等四个步骤。

取材:取材是原代培养的第一步。用灭菌的器械切取合适大小的动物器官或组织块，用平衡盐溶液对组织进行洗涤去除血污，剔除组织附带的脂肪组织、结缔组织和坏死组织。操作过程中注意防止污染，并需用平衡盐溶液保持组织块的湿润。取材范围通常包括动物胚胎、成年动物组织、人体手术中的切下组织等。如将组织切成1mm³的小块，即可直接用于植块培养。

培养材料的制备:通过机械解离、胰酶消化、螯合剂解离等方法，将取材获得的组织块分散成为单细胞悬液，包括过滤除去组织块、离心收集单细胞、重新用培养液悬浮细胞、计数、调节细胞密度等步骤。

接种和培养:将制备好的植块或细胞悬液放入培养环境中生长，这个过程称为接种和培养。对于植块，需要将它们用吸管或镊子小心地排列在培养瓶的底部，加入少量的培养基，待植块充分贴壁后(一般在恒温箱中培养过夜)，再补加足够的培养基，放入恒温培养箱中继续培养。对于单细胞悬液，只要按照需要的细胞密度加入培养瓶(皿)中，加入足够的培养基，即可放到培养箱中进行培养。注意观察细胞的生长情况，当营养耗尽时，需及时更换培养液。当细胞生长出现接触抑制时，即可进行传代培养。

三、实验材料及器材

(1)9～10日龄鸡胚。

(2)Hank's液50ml、0.5%水解乳蛋白液或MEM培养液20ml(内含犊牛血清1ml，双抗0.2ml，pH7.2)、0.25%胰蛋白酶5m、7%NaHCO₃1ml。

(3)手术剪、镊子、灭菌的培养皿、50ml三角瓶、滴管若干、链霉素小空瓶若干(加入细胞悬液培养用)、高压灭菌塞子若干、培养盘、蛋座、95%酒精、水浴锅。

四、实验步骤

(1)配液:制备细胞前先在Hank's液中加青霉素、链霉素，使其含量为青霉素100IU/ml，链霉素100μg/ml，用7%NaHCO₃调整至pH至7.2～7.4，将胰蛋白酶调整至pH7.6(玫瑰红色)。置37℃水浴锅中预热备用。

(2)取胚及剪碎:将胚蛋气室端向上直立于蛋座上，用碘酊消毒气室，以镊子击破卵壳并弃之，撕破卵膜并揭之，继撕破绒尿膜、羊膜，取出胚胎于灭菌平皿中。剪去头部、翅爪及内脏，用Hank's液(简称H液)洗去体表血液，移入灭菌三角瓶中，用灭菌剪刀剪碎鸡胚，使其成为约1mm³大小的碎块，加5ml Hank's液轻摇，静止1～2min，使其组织块下沉。吸去上层悬液，依同法再洗2次，至上层悬液不混浊为止，吸干Hank's液留组织。

(3)消化:自水浴锅内取出37℃预热的胰酶，按组织块体积3～5倍加入三角瓶中，1个鸡胚约需5ml胰酶，三角瓶上加塞，以免污染。37℃水浴20min左右，每隔5min轻轻摇动1次，由于胰酶作用，使细胞与细胞之间的氨基和羧基游离，待液体变混而稍稠，此时再轻摇可见组织块悬浮在液体内而不易下沉，此时需中止消化，如再继续消化可破坏细胞膜而不易贴壁生长，如果消化不够，则细胞不易分散。

(4)洗涤:取出三角瓶后静置1min，让组织块下沉，吸去胰酶液，用10ml Hank's液反复轻洗3次，以洗去胰酶，吸干上清液，留组织块。

(5)吹打:加2ml含血清的0.5%水解乳蛋白营养液或MEM培养液，以粗口吸管反复吹吸数次，使细胞分散，此时可见营养液混浊即为细胞悬液。静置1min，使未冲散的组织块下沉后，小心地将细胞悬液吸出1ml于20ml营养液中，此液细胞数50万～70万/ml。如需大量细胞，可继续加营养液冲打，一个鸡胚约可做100ml细胞悬液。

(6)细胞计数:取上述细胞悬液0.5ml加入0.1%结晶紫-柠檬酸(0.1mol/L)溶液2ml，置室温或37℃温箱中5～10min，充分振动混合后，用毛细管吸取并滴入血细胞计数板内，在显微镜下计数。计数方法按白细胞计数法，计算四角大格内完整细胞的总数。如3～5个聚集在一起，则按1个计算，然后将细胞总数按下法换算成每毫升中的细胞数。

细胞数/ml=4大格细胞总数/4×10000×稀释倍数

例如:4大格的细胞总数为284个，而稀释倍数为5(0.5ml染色液)，则每毫升细胞悬液的细胞数为个。

(7)稀释:按照每毫升50万～70万个细胞密度的标准，将细胞悬液用营养液稀释之。 (计数时，可见大部分细胞完整分散，3～5个细胞成堆，且细胞碎片很少，说明消化适度;如分散细胞少，则消化不够;如细胞碎片多，则消化过度。 )

可采用活细胞计数法来检测活细胞数量:取2%台盼蓝溶液1滴，细胞悬液1滴，混合计数，活细胞不着色，死细胞呈蓝色。

(8)分装培养:将稀释后的细胞培养液分装于细胞培养瓶中，每瓶约1ml，瓶口橡皮塞要塞紧。不合适者弃去，以免漏气造成污染或CO₂跑掉使营养液呈碱性。将细胞瓶横卧于培养盘中，于瓶上面画一直线，以表示直线的对侧面为细胞在瓶内的生长位置。瓶上注明组别、日期，置37℃温箱培养，4h后细胞即可贴附于瓶壁，24～36h生长成单层细胞，此时可吸去培养液，更换维持液，并接种病毒。

五、方法评注

原代细胞是指直接来源于动物组织的细胞、动物组织经胰酶消化后培养成单层细胞(通常贴壁生长)，原代细胞具备广泛的敏感性;无DNA突变，无致肿瘤性等优点，因此原代细胞可用于病毒的培养、疫苗生产等。但原代细胞存在着潜在的病毒等外源因子污染;来自不同个体动物的细胞质量和敏感性有差异等问题，鉴于原代细胞的上述缺点，生产减毒活疫苗的动物应尽可能达到SPF级，至少应采用健康动物;采用等级动物的原代细胞或传代细胞以及二倍体细胞是将来生产灭活疫苗的发展方向。用于疫苗生产的原代细胞主要有地鼠肾细胞、猴肾细胞、兔肾细胞、鸡胚细胞等。

实验二十七　细胞的冻存与复苏

一、实验目的

掌握细胞冻存与复苏的方法。

二、实验原理

在低于－70℃的超低温条件下，细胞内部的生化反应极其缓慢，甚至终止。因此，采取适当的方法将生物材料降至超低温条件，即可使生命活动固定在某一阶段而不衰老死亡。当以适当的方法将冻存的生物体恢复至常温时，其内部的生化反应可恢复正常。

三、实验材料及器械

HeLa细胞、1640培养基、胰酶、冻存液、移液管、冻存管、培养瓶、抽滤器。

四、实验步骤

(1)待冻存细胞悬液的准备。

①按常规方法消化处于对数生长期的细胞培养物，制备成单细胞悬液。

②将细胞悬液以800～1000r/min离心5min，弃上清液。计算细胞总数。

③向沉淀物中加入冷冻液。轻轻吹吸均匀，使细胞密度达1×10⁶～1×10⁷个/ml。

(2)按每管1～1.5ml的量，分装于冻存小管内，拧紧管盖。

(3)在冻存小管上做标记，包括细胞代号及冻存日期。

(4)分级冷冻。

①先将冻存小管放入普通冰箱下层(4～8℃)，约40min。

②接着置于普通冰箱上层冰盒(－10～－20℃)，30～60min。

③然后在－70～－80℃下过夜。

④最后将冻存小管放入液氮保存。

(5)复苏过程。

①调配37～40℃的温水，或将恒温水浴箱的温度调至37～40℃。

②从液氮中取出冻存小管，立即投入37～40℃温水中快速晃动，直至冻存液完全融解。要在1～2min内完成复温。

③将细胞冻存悬液移入离心管，加入约5m1培养液，轻轻吹匀。

④将细胞悬液经800～1000r/min离心5min。弃上清液。

⑤给细胞沉淀物加入完全培养液，轻轻吹吸均匀。将细胞悬液移入培养瓶内，加足培养液进行培养。

实验二十八　单抗的制备

一、实验目的

掌握用杂交瘤法制备单克隆抗体的基本方法。

二、实验原理

B淋巴细胞能够产生抗体，但在体外不能进行无限分裂;而瘤细胞虽然可以在体外进行无限传代，但不能产生抗体。这两种细胞融合后得到的杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性。即既可以无限传代，又同时可以产生抗体。本实验将学习利用PEG使细胞融合并使细胞单细胞化得到表达单克隆位点抗体的细胞株。

三、试验材料及器械

(1)动物:BALB/C小鼠，6～8周龄，雌性。SP2/0～Agly。

(2)细胞系:HGRT阴性骨髓瘤细胞株。

(3)主要器材:超净工作台(带紫外)、二氧化碳培养箱、液氮罐、倒置显微镜、24孔及96孔细胞培养板、组织培养瓶、细胞冻存管、4℃冰箱、 －20℃冰箱、 － 80℃冰箱、离心机、分析天平(德塞托利斯)、酶标仪、微量可调加样器、电磁搅拌器。

(4)主要试剂:免疫抗原(HA)、弗氏完全佐剂、淋巴细胞分层液、 Pristane (降植烷， Sigma )、 PEG (Merck )、8-AG (Sigma)、RPMI 1640 (Gibco，USA)、H、A、T (Sigma)、DMSO (Merk)、胎牛血清、羊抗鼠Ig类及亚类血清、琼脂、酶标羊抗鼠Ig (Sigma)、羊抗鼠血清、Tris (Servia)、抗HA抗体。

(5)主要试剂配制:

①RPMI1640液:取RPMI 164010.4g×10包，在电磁搅拌下溶于10L纯净水，加入NaHCO₃20g，青霉素及链霉素各10⁸U，用CO₂校正pH值至6.6左右，0.22μm微孔膜除菌过滤，无菌试验合格后于-20℃备用。

②20%FCS RPMI 1640培养液:将FCS与RPMI1640液按1∶4体积混合。

③HAT选择培养液及HT培养液:称取A1.76mg溶于100ml纯净水配制100×A浓缩液，0.1mol/L NaOH促溶，0.1 mol/L HCl校正pH值，除菌过滤后于－20℃保存。按同法称取H136.1mg及T38.8mg溶于100ml纯净水配制100×HT浓缩液。用20% FCS RPMI1640培养液将100×HT +100×A或100×HT分别稀释100倍即为HAT选择培养液或HT培养液。

④50% PEG (W/V):称取50g PEG (MW=4000U)，经流通蒸汽融化和灭菌，趁热在无菌条件下加入预温的RPMI 1640液50ml。分装后于常温保存。

⑤pH9.6，0.05 mol/L CB:称取NaHCO₃2.93g，Na₂CO₃1.59g溶于1000ml双蒸水，置4℃备用。

⑥pH7.4，0.01 mol/L PBS-T:称取Na₂HPO₄·12H₂O 2.90g，NaH₂PO₄·2H₂O 0.296g，NaCl 8.5g，溶于1000ml双蒸水，并加入0.05% Tween20。

⑦OPD底物缓冲液:称取Na₂HPO₄·12H₂O 18.4g，柠檬酸5.2g溶于1000ml双蒸水，配制成pH5.0，0.1 mol/L磷酸盐-柠檬酸缓冲液。

⑧1.2%琼脂:1.2g琼脂粉溶于100ml生理盐水，水浴煮沸至肉眼见无颗粒，加入NaN₃防腐，分装，于4℃保存。

⑨0.05%考马斯亮蓝染液:将50mg考马斯亮蓝R250溶于100m1脱色液(甲酵∶乙酸∶蒸馏水=5∶1∶5)。

⑩饱和硫酸铵:将900g硫酸铵在50℃溶于1000ml双蒸水中并于室温过夜，调整pH值至7.2。

pH7.0，0.1 mol/L TBS:取Tris 12.1g，NaCl 5.85g及浓盐酸7.5ml溶于1000ml双蒸水。

四、试验步骤

1.动物免疫

取6～8周雌性BALB/c小鼠，将HA抗原200μl溶于2ml生理盐水与等体积福氏完全佐剂充分乳化，于小鼠两侧腹股沟及腹腔内注射，每只小鼠注射0.5ml，两周后重复注射，共免疫三次，于最后一次免疫后第7天取眼眶血测免疫效价。融合前3天，用乙醚麻醉小鼠，切开左侧皮肤及腹膜，暴露脾脏，用25μl HA抗原粗提物于脾内多点注射以加强免疫，缝合腹膜及皮肤。

2.骨髓瘤细胞

取经8-AG处理过的SP2/0骨髓瘤细胞在20% NBS-RPMI 1640细胞培养液中培养至一定密度后，1000r/min离心5min，去上清液，用无NBS的RPMI 1640液离心洗涤二次，再用此液配成1×10⁷个/ml的细胞悬液，注射于Balb/c小鼠背部近尾端两侧皮下，每侧0.25ml。经10～14天，便可获得一定大小的实体瘤。融合当日拉颈处死小鼠，将其放入75%酒精中浸泡5min，无菌取出肿瘤实体部分，置于盛少许细胞洗液的塑料管中，用外包塑料的研磨棒研成匀浆，补加细胞洗液至10ml，静置数分钟，将细胞悬液轻轻地加到淋巴细胞分层液上，二者比例为2∶1，1800r/min离心20min，吸出界面活性瘤细胞，用RPMI 1640离心洗涤两次，计数待用。

3.饲养细胞的制备

取正常Balb/c小鼠腹腔巨噬细胞或脾细胞作为饲养细胞。

腹腔巨噬细胞:取健康8～10周龄Balb/c小鼠拉颈处死后，将其置于75%酒精中浸泡5min，在无菌操作下，用注射器或吸管向腹腔注入5ml细胞洗液，静置数分钟，抽出洗液，用无血清RPMI 1640洗涤两次，计数后即可作为细胞融合或克隆时的饲养细胞，每只小鼠约可获3×10⁶～5×10⁶个腹腔巨噬细胞。

4.细胞融合

将经尾静脉或脾内加强免疫后第三天的小鼠放血处死，并取血用于检测免疫效果。自来水冲洗后置75%酒精浸泡5min，将小鼠右侧卧位固定，无菌操作下，剪开腹部皮肤，暴露腹膜，于脾脏处剪开腹膜，取出脾脏，除去脂肪及结缔组织，沿脾脏纵轴剪开数段，置于有少许细胞洗液的玻璃管中，用组织研磨棒将脾脏研成匀浆，补加细胞洗液至10ml，静置数分钟，取细胞悬液用细胞洗液离心洗涤两次，去上清液，制成悬液，计数待用。

将SP2/0骨髓瘤细胞与免疫脾细胞按1∶5比例混合，1400r/min离心8min。倒掉上清液后再用吸管仔细吸尽残留的液体，轻轻弹击管底，使细胞沉淀略松动。将试管放入37℃的水溶液中，按10⁸个免疫脾细胞加入50% PEG (MW为4000U)0.8ml计算，吸取预温至37℃的50%PEG，先用吸管尖轻轻搅拌细胞沉淀团，使骨髓瘤细胞与脾细胞充分混合，缓慢在1min内加完，并边加边轻轻搅拌，加完PEG后再继续搅拌1.5min。然后在5min内慢慢加入37℃预温的细胞洗液10ml，具体为:第一、二分钟各为1ml，第三、四分钟各为1.5ml，第五分钟为5ml，每次加时要缓慢滴入，并不断轻轻搅拌。最后加入饲养细胞(按96孔板每孔加入1×10⁵ ～2×10⁵个脾细胞计，如为腹腔渗出细胞，则每孔加1×10⁵～2×10⁵个)，补加细胞洗液至30～50ml，1000r/min离心5min，弃上清液后加入HAT选择培养液，并接种于96孔组织培养板中，每孔0.2ml (按免疫脾细胞计每孔加入2×10⁵个)。融合后的细胞置CO₂培养箱中培养(37℃，5%CO₂)，第四天换HAT培养液，第七天换HT培养液，各为0.1ml/孔。10～15天挑选有克隆生长的孔吸出上清液并检测。

5.杂交瘤细胞的筛选

采用ELISA检测。用抗原包被40孔微量反应板，每孔50μl，于4℃过夜或37℃2h。用洗涤液洗涤三次，每次3min。以含10% NBS的封闭液0.2ml/孔4℃过夜或37°C2h封闭。按上法洗三次后，加待测上清液50μl/孔，37℃孵育2h，并用无关McAb作阴性对照，免疫小鼠血清作阳性对照。洗涤三次后，加入HRP标记的兔抗鼠IgG结合物50μl/孔，37℃孵育2h。洗涤三次后，每孔加入0.1ml OPD底物溶液，室温反应20min后每孔加入2mol/L H₂SO₄ 100μl终止反应，酶标仪读OD值，以OD值大于阴性对照2.1倍者为阳性。

6.克隆与再克隆

采用有限稀释法。挑选强阳性孔细胞克隆(最好是单克隆)，用细胞培养液作一定稀释后，使每毫升含细胞数分别为50、10、5，每孔0.1 ml接种于96孔培养板，使杂交瘤细胞理论上平均每孔细胞数为5个、1个、0.5个，同时加入饲养细胞，置于37℃、5%CO₂孵箱中培养10天左右，进行ELISA检测，挑选强阳性单克隆孔进行再克隆和第三次克隆，直至抗体阳性率达100%。

7.McAb的制备和纯化

(1)培养上清液的制备:经克隆化筛选出的杂交瘤细胞接种于20%NBS-RPMI 1640培养液中，扩大培养，待大部分细胞濒临死亡时，将培养液离心，收集上清液置－30℃保存。

(2)腹水制备:取8～10周龄雌性Balb/c小鼠，腹腔注射降植烷，每只0.5ml，7～10天后腹腔接种杂交瘤细胞5×10⁵个/只，注射量为0.5ml。10～15天后出现腹水，在小鼠濒死前处死，一次性收集腹水。先置37℃30min，使纤维蛋白凝块析出，再3000r/ min离心30min，吸取中段透明液体分装后于－30℃保存备用。

(3)腹水McAb提纯和鉴定:采用辛酸-硫酸铵沉淀法。将腹水用滤纸或纱布过滤，按1∶4加入pH4.0，60mmol/L醋酸盐缓冲液稀释腹水。按0.025ml/ml量，在电磁搅拌下，缓慢加入辛酸，随后继续搅拌30min，2500r/min离心1h，计算并收集上清液。按1∶10量加入pH7.4，0.2mol/L PBS，用3mol/L NaOH调pH值至7.4。按0.277g/ml加入硫酸铵，至45%饱和度，边加边搅拌30min，于4℃静置30min后，4℃下2500r/min离心1h，弃上清液。沉淀用pH7.4，0.02mol/L PBS溶解后，透析至无硫酸铵残余(用钠氏试剂测定)。4℃，3000r/min离心20min，去变性蛋白，收集上清液。

(4)腹水蛋白及纯化Ig定量测定:将腹水以及纯化后的Ig按一定比例稀释，用紫外分光光度计测定波长280nm的OD值，根据公式蛋白(mg/ml)= OD₂₈₀×稀释倍数/1.4计算蛋白质量，或用Lowry法精确测定蛋白含量。

腹水组分的测定和纯化后Ig纯度的鉴定采用醋酸纤维薄膜电冰法，并将膜固定后用可见光扫描鉴定其纯度。

培养上清液、腹水和纯化Ig用ELISA间接法测定抗体效价或抗体活性。

五、方法评注

该技术于1975年由科学家Milstein和Kohler发明，它是应用B细胞杂交瘤技术产生单克隆抗体(McAb)，将产生抗体的单个B淋巴细胞同肿瘤细胞杂交，获得既能产生抗体，又能无限增殖的杂种细胞，并以此生产抗体的技术。1984年Kohler与Milstein由于该发明获得诺贝尔生理医学奖。

单克隆技术现在广泛应用于临床诊断中，单克隆抗体技术也同样可应用于治疗研究中，但均处于摸索阶段。如抗人T细胞单克隆抗体可用于治疗白血病、移植物抗宿主反应(GVHD)和急性肾排斥等。