细胞培养基本技术

(一)培养用品清洗

1.玻璃制品清洗 玻璃器皿的清洗包括浸泡、刷洗、浸酸、冲洗。

(1)浸泡:初次使用的玻璃器皿要用5%的稀盐酸浸泡过夜,以中和其表面的碱性物质和有细胞毒性的铅、砷等物。使用后的玻璃器皿表面常常附着大量蛋白和油脂,凝固后不容易刷洗干净,故应及时放入水中浸泡,以备刷洗。

(2)刷洗:浸泡后的玻璃器皿放到含有洗涤剂(不能用含沙粒的去污粉)的水中,用软毛刷反复刷洗,去除器皿内外表面杂质。刷洗中,不能留死角,应特别注意瓶角、瓶底等部位。最后用自来水(如有条件可再用蒸馏水)冲洗、晾干。

(3)浸酸:将上述玻璃器皿浸泡于由浓硫酸和重铬酸钾配置的清洁液,这是清洗过程中的关键一环。这种清洁液有强氧化性,去污能力强,对玻璃器皿无腐蚀。浸酸时一定要做好个人防护,动作轻柔,以防被清洁液灼伤。浸酸用器皿内应充满清洁液,勿留气泡。浸酸时间不可少于6h,一般要过夜或更长。浓硫酸-重铬酸清洁液可根据需要配制成不同强度,其成分用量见表9-1。

配制清洁液时,要做好防护,最好戴耐酸手套和围裙。配制过程中,先将重铬酸钾溶于蒸馏水,然后将浓硫酸缓慢倒入。由于加入浓硫酸会产生热量,所以配制时要不停地搅拌散热,并促进两者充分混合。新配制的清洁液呈棕红色,随着使用次数增多会逐渐变为绿色。这表示清洁液已失效。次强液较常用。

(4)冲洗:浸酸后应充分冲洗。可手工冲洗,有条件的实验室也可用洗涤装置冲洗。应保证每个器皿流水冲洗10次以上,到无任何残液为止。最后蒸馏水漂洗2~3次,三蒸水漂洗1~2次,烘干备用。

表9-1　浓硫酸——重铬酸钾清洁液配制表

2.橡胶制品清洗 细胞培养中所用的橡胶制品主要是胶塞和培养瓶盖。胶塞、瓶盖使用后应及时刷洗干净,放入2%NaOH煮沸10~20min。冲洗干净后用1%稀盐酸浸泡30min,自来水冲洗后再用蒸馏水漂洗2~3次,晾干备用。新购置的胶塞、盖子应先用自来水清洗干净,再做常规处理。

3.金属器械清洗 新的金属器械擦去防锈油后用蒸馏水冲洗,然后用乙醇棉球擦拭干净。用过的金属器械应及时把污染物擦掉,再用乙醇棉球擦拭干净。

4.塑料制品清洗 塑料制品包括培养皿、培养板、培养瓶、塑料滤器等。先把塑料制品擦拭干净,入2%NaOH浸泡过夜,自来水冲洗,5%盐酸浸泡30min,流水冲洗,蒸馏水漂洗干净,晾干。

5.滤器清洗 玻璃滤器清洗比较麻烦,整个清洗过程需要1周左右,现在多淘汰不用。正压滤器,需用稀释过的洗涤剂反复刷洗,流水冲洗、蒸馏水浸泡,烘干备用。

(二)培养用品包装、消毒

1.包装 清洗烘干过的器皿要先经过包装再做消毒处理,以防消毒灭菌后再次受到污染。常用的包装材料有牛皮纸、棉布、金属饭盒、特制玻璃消毒筒等。对瓶口的简便包装方法是用牛皮纸、硫酸纸、锡箔把瓶口封住。体积较小的培养皿、注射器、胶塞、金属器械、吸管等可直接放入可封闭容器。

2.消毒 消毒处理是防止污染发生的重要环节。消毒方法有物理和化学方法两大类。物理方法包括湿热消毒、干热消毒、紫外线消毒、滤过消毒等;化学方法则是用消毒剂和抗生素杀灭微生物。实践中可根据物品种类选用适合的方法消毒。

(1)湿热消毒:这是最有效的消毒方法,用于对玻璃器皿、金属器械、布类、一些不含对高温高压敏感成分的培养液等物品的消毒。为保证消毒效果,消毒器内的被消毒物品不宜装的太满,以便气体流通。物品不同消毒所用的温度和时间也不一样。一般情况下,培养液、橡胶制品、塑料制品消毒为115℃、10min;玻璃器皿、金属器械、布类消毒为121℃、15~20min。

(2)干热消毒:主要用于玻璃器皿消毒。一般消毒为160℃、90~120min,这能够在灭菌同时杀死芽胞。

(3)紫外线消毒:主要用于空气、操作台和一些不宜用其他方法消毒的物品,进入无菌室前和实验完成后均应打开紫外线灯照射30min。紫外线照射60min可杀灭空气中的大部分细菌。在使用紫外线消毒时应注意环境条件,在温度低于4℃或空气湿度大于50%时,照射时间应适当延长。

(4)滤过消毒:主要用于培养液的消毒,常用的有正压不锈钢滤器、抽滤式玻璃滤器和针头滤器。滤器中起滤过消毒作用的是滤膜,常用滤膜孔径为0.22μm。通过滤过消毒可除去培养液和试剂中的细菌,滤过2次可基本除去支原体,但不能除去病毒。

(5)消毒剂和抗生素:细胞培养时也可用消毒剂进行消毒处理。常用消毒剂有碘酒、75%乙醇、过氧乙酸、乳酸、来苏水等。操作者皮肤、培养瓶口可用碘酒、乙醇消毒;无菌室内的桌椅、操作台面可用0.1%新洁尔灭、过氧乙酸、来苏水擦拭;无菌室可用乳酸熏蒸。

抗生素应加到培养液中,以预防和抑制细菌污染。常用方法是将青霉素(100U/ml)和链霉素(100μg/ml)联合加入培养基。现在很多实验室用的培养基购入前已常规加入了抗生素。原代培养应尽量不用抗生素,因为从动物体内获得的细胞多是无菌的,原代培养时细菌污染机会相对较小。

(三)无菌操作

无菌操作是决定细胞培养成败的关键。实验用品使用前需严格消毒,实验过程中应始终保持无菌。操作者进入无菌室前必须彻底洗手并按外科手术要求着装。实验操作要在超净工作台上进行,实验前应先点燃酒精灯,安装吸管帽、打开或封闭瓶口等一切操作均应在灼烧消毒后进行。台面用品要放置有序,操作有序,切忌忙乱。细胞及培养用品在未处置、使用前,不应过早暴露于空气。应用不同吸管吸取不同培养液,切忌混用。已消过毒的器皿不可以用手触及,如不慎触及要及时用火焰灼烧消毒,甚至换用备用品。

(四)取材

组织、细胞取材后应尽早培养,如不能及时培养,可用培养液浸泡,存放于4℃冰箱。如组织块较大,应先切成1cm3以下小块低温保存,但保存时间原则上不能超过24h。取材要严格遵循无菌操作原则,应选用锋利器械切碎组织,以尽可能减少细胞的机械损伤。当组织样本带有血液、脂肪、结缔组织及坏死组织时应细心剔除,修剪应在培养液中进行。取材后应详细记录组织来源、部位、供体情况等,以便查询。以下介绍几种常见的组织、细胞取材方法。

1.肿瘤组织取材 尽可能避开坏死组织,从肿瘤细胞较多部位取材。

2.皮肤和黏膜取材 尽量获取上皮细胞,组织不要切的过厚,并尽量去除携带的皮下组织。对与外界相通部位组织取材时应严格消毒,可先用含青霉素(500~1000U/ml)、链霉素(100μg/ml)的培养液漂洗5~10min。

3.血细胞取材 一般采用静脉取血,也可指尖或耳垂取血。为防止血液凝固,采血管应先加入20U/ml的肝素。在制备血细胞悬液时,应选择低速离心500~1000r/min,时间5~10min。离心速度不宜过高,时间不宜过长,以免细胞因挤压而损伤。

(五)组织细胞分离方法

1.机械分散法 用机械方法研磨组织,吸取组织悬液,通过细胞筛获得细胞悬液。此方法简单,便于操作,但易造成细胞损伤,且对较硬组织分散的效果不好。

2.消化分散法 借助消化剂将已剪成1~2mm3组织块分散的方法,常用的消化剂有胰蛋白酶、胶原酶等。此种方法可使组织松散,细胞成活率较高,容易生长。根据消化剂,该方法又分为胰蛋白酶消化法与胶原酶消化法。

(1)胰蛋白酶消化法:适用于细胞分散间质或较少的松软组织,如胚胎、上皮、肝、肾等。将要分散的组织剪成1~2mm3的小块,加入30~50倍体积、预温至37℃的0.25%胰蛋白酶,37℃水浴、消化30~60min,也可在4℃冰箱中冷消化12~24h。消化完毕将细胞悬液用培养液漂洗1~2次(每次离心800~1000r/min、3~5min),弃上清,制成细胞悬液备用。为提高消化效果,可将0.02%EDTA和0.25%胰蛋白酶按1∶1或2∶1的比例制成消化剂。由于EDTA会改变培养液中的钙离子浓度,影响细胞贴壁和生长,消化终止后必须离心将其去除。

(2)胶原酶消化法:胶原酶对细胞间质有消化作用,但对上皮细胞影响不大,适用于消化纤维组织、上皮和肿瘤组织。将需要分散的组织剪成1~2mm3的小块,加入3~5倍体积的200U/ml胶原酶,水浴消化4~48h(具体时间视情况而定,以组织块消失为准)。培养液漂洗1~2次(每次离心1000r/min、3~5min),弃上清,制成细胞悬液备用。

(六)细胞计数及密度换算

只有在一定数量范围内加入培养瓶的细胞才能维持最佳生长状态。因此,细胞培养前需要计数细胞,并进行稀释处理。常用细胞计数板或电子细胞计数仪进行细胞计数。这里仅介绍细胞计数板计数法。收集培养细胞制成单细胞悬液,要求细胞密度不低于104个/ml。吹打均匀,吸取少许细胞悬液轻轻注到盖玻片边缘与计数板交界处,加样量以细胞悬液充满盖玻片和计数板间隙,但不溢出盖玻片,也无气泡为宜。显微镜下,以10×物镜观察计数板四角大方格中的细胞数,细胞压线时只计左侧和上方者,不计右侧和下方者。每个大方格中的细胞密度以20~50个为宜。如细胞浓度过大,应稀释后再次计数。原液中细胞密度(细胞数/ml)=四个大方格活细胞数之和/4×104×稀释倍数。