组织细胞内酶促反应的外界条件

动物细胞的原代培养_动物细胞培养技术

任务1　动物细胞的原代培养

原代培养是指通过组织块直接长出的单层细胞，或用化学和物理方法将组织分散成单个细胞开始培养，在首次传代前的培养皆可认为是原代培养。原代培养最大的优点是，组织和细胞刚刚离体，生物性状尚未发生很大变化，在一定程度上能反映体内状态。特别是在细胞培养汇合时，原代培养的某些特殊功能表达尤为强烈，在这样的培养阶段能更好地显示与亲体组织紧密结合的形态学特征。在供体来源充分、生物学条件稳定的情况下，采用原代培养做各种实验，如药物测试、细胞分化等，效果尤佳。但应注意，原代培养组织是由多种细胞成分组成的，比较复杂。即使全为同一类型的细胞，如上皮细胞或成纤维细胞，也仍具有异质性，在分析细胞生物学特性时比较困难。其次，由于供体的个体差异及其他一些原因，细胞群生长效果有时也不一致。

一、培养细胞的取材与分离

（一）培养细胞的取材

动物体内绝大部分组织细胞都可以在体外培养，但培养的难易程度与组织类型、分化程度、供体的年龄、原代培养方法等直接相关。原代取材是进行组织细胞培养的第一步，若取材不当，将会直接影响细胞的体外培养。

1.取材的基本要求

（1）所取组织最好尽快培养。

取材时应尽量在4～6h内制成细胞，尽快入箱培养。因故不能即时培养的，可将组织浸泡于培养液内，放置于冰浴或4℃冰箱中。如果组织块很大，应先将其切成1cm³以下的小块于培养基内4℃存放，但时间不能超过24h。

（2）取材应严格无菌。

取材应在无菌条件下进行。使用无菌包装的器皿或用事先消毒好的、带少许培养液（内含400U／mL抗生素）的小瓶等便于携带的物品取材。所取材料要尽量避免紫外线照射和接触化学试剂（如碘、汞、酒精等）。从消化道、周围有坏死组织等疑有污染因素存在的区域取材时，为减少污染，可用500～1000U／mL的青链霉素平衡盐溶液漂洗5～10 min再做培养，以确保所取材料无菌。

（3）防止机械损伤。

在取材和原代培养时，要用锋利的器械（如手术刀片或剃须刀片）切碎组织，尽可能减少对细胞的机械损伤。

（4）去除无用组织和避免干燥。

对于组织样本带有的血液（血块）、脂肪、神经组织、结缔组织和坏死组织，取材时要细心除去。为避免组织干燥，修剪和切碎过程可在含少量培养液的器皿中进行。

（5）营养要丰富。

原代培养，特别是正常细胞的培养，应采用营养丰富的培养液，最好添加胎牛血清，含量以10%～20%为宜。

（6）培养组织的正确选择。

取材时应注意组织类型、分化程度、年龄等因素。要采用易培养的组织进行培养。一般来说，胚胎组织较成熟个体的组织容易培养，低分化的组织较高分化的组织容易生长，肿瘤组织较正常组织容易培养。

（7）注意保存原代组织的相关材料及信息。

为了便于以后鉴别原代组织的来源和观察细胞体外培养后与原组织的差异，原代取材时要同时留好组织学标本和电镜标本。对组织的来源、部位，以及供体的一般情况要做详细的记录，以备以后查询。

2.取材的基本器材和用品

（1）眼科组织弯剪、弯镊、手术刀（用前消毒）。

（2）装有无血清培养基或Hank′s液的小瓶。

（3）烧杯或锥形瓶（10mL、50mL）。

（4）培养皿。

3.各类组织的取材方法

（1）皮肤和黏膜的取材。

皮肤和黏膜是上皮细胞培养的重要组织来源，也可以获得成纤维细胞。皮肤和黏膜主要取自手术过程中的皮片，方法似外科取断层皮片手术的操作，但面积一般为2～3mm²即可。这样局部不留瘢痕。取材时不要用碘酒消毒。

皮肤和黏膜培养多是以获取上皮细胞为目的，因而无论何种方法取材都不要切取太厚，并要尽可能去除所携带的皮下或黏膜下组织。如欲培养成纤维细胞则反之。皮肤、黏膜分布在机体外部或与外界相通的部位，表面细菌、霉菌很多，取材时要严格消毒，必要时用较高浓度的抗菌素溶液漂洗、浸泡。

（2）内脏和实体瘤的取材。

内脏除消化道外基本是无菌的，内脏和实体瘤取材时，一定要明确和熟悉自己所需组织的类型和部位，要去除不需要的部分如血管、神经和组织间的结缔组织；实体瘤取材时要尽可能取肿瘤细胞丰富的区域，避开破溃、坏死、液化部分，以防污染。但有些复发性、浸润性较强的肿瘤，较难取到较为纯净的瘤体组织，其肿瘤组织与结缔组织混杂在一起，培养后会有很多纤维细胞生长，给以后的培养工作带来困难。

（3）血液细胞的取材。

血液中的白细胞是很常用的培养材料，常用于进行染色体分析、淋巴细胞体外激活进行免疫治疗等。一般抽取静脉外周血，微量时也可从指尖或耳垂取血。取材时应注意抗凝，通常采用肝素抗凝剂，常用肝素浓度为8～20U／mL，抽血前针管也要用浓度较高的肝素（500U／mL）润湿。抗凝剂的量以产生抗凝效果的最小量为宜，量过大时易导致溶血。抽血时要严格无菌。

（4）骨髓、羊水、胸水、腹水内细胞的取材。

取此类标本时，除严格无菌，注意抗凝外，还要尽快分离培养。这几种样品取材后一般不需要其他处理，离心后用无Ca^2＋、Mg^2＋的PBS洗两次，再用培养基洗一次即可培养，不宜低温保存。

（5）动物组织的取材。

①鼠胚组织的取材。

鼠胚组织易于培养，同时鼠与人类相近，都是哺乳类动物，因此鼠胚组织已成为较常用的培养材料。由于小鼠的毛中隐藏的微生物较多，而且不易消毒，所以取材时更要注意无菌消毒，其无菌消毒一般采用以下方法进行：首先用引颈或气管窒息致死法杀死孕期合适的动物，然后将其整个浸入盛有75%酒精的烧杯中5min（注意时间不能太长，以免酒精从口和其他孔道进入体内，影响组织活力）。取出动物后放在消毒后的小木板上，用无菌的图钉或大头针固定四肢，然后用眼科剪和止血钳剪开皮肤，解剖取材。也可在酒精消毒后，沿动物躯干中部环形剪开皮肤，用止血钳分别挟住两侧皮肤拉向头尾把动物反包，暴露躯干，然后固定，更换无菌剪解剖取材，采用无菌操作法解剖，取出胚胎。取好的组织要放置在另一干净的培养皿中或玻璃板上进行原代培养操作。动物消毒后的操作宜在超净工作台内或无菌环境中进行。鼠胚组织的取材如图1-42所示。

②幼鼠胚肺（肾）的取材。

幼鼠处死消毒方法同上，腹部朝上固定在木板上，切开游离毛皮并拉开至两侧。采用无菌法打开胸腔取肺，或背部朝上固定在木板上，先将背部皮毛切开游离并拉向两侧，然后采用无菌法从背部打开腹腔取肾。

③鸡胚组织的取材。

鸡胚是组织培养经常利用的材料，一般使用鸡胚时应自行孵育。主要步骤如下：精选新鲜受精鸡蛋，擦掉表面的脏物，置于37℃培养箱中孵育，箱内同时放一盛水的水盘以维持培养箱内的湿度。取孵化至适当胚龄（9～11d，在此期间，每天翻动鸡蛋一次）的胚蛋。用照蛋灯在暗处灯检，如有丰富血管、胚体有运动，说明胚体发育良好，用有色笔画出气室和胚体位置。将胚蛋以气室（大头）向上置于蛋架上，用温水清洗蛋壳，再用75%酒精棉球擦干。经碘酒、75%酒精消毒后，无菌条件下，用剪刀或中号镊子打开气室，沿气室边缘环行剪除蛋壳，用眼科镊撕去蛋膜，暴露出鸡胚，用钝弯头玻璃棒伸入蛋中轻轻挑起鸡胚，放入无菌培养皿中，解剖取材。

图1-42　鼠胚组织的取材

（a）断髓处死；（b）酒精消毒；（c）环形剪开皮肤；（d）外翻剥皮；（e）打开腹腔；（f）取出双子宫；（g）取胚胎

4.组织材料的分离

从动物体内取出的各种组织均有结合相当紧密的多种细胞和纤维成分，不利于各个细胞在体外培养中生长繁殖，即使采用1mm³的组织块，也仅有少量处于周边的细胞可能生存和生长。若要获得大量生长良好的细胞，须将组织块充分分散开，使细胞解离出来。另外，有些实验需要提取组织中的某些细胞，也须首先将组织解离，然后才能分离出细胞。目前常采用的方法有机械法和化学法两种，可根据组织种类和培养要求，选用适宜的方法。

（1）细胞悬液的分离方法。

对于血液、羊水、胸水和腹水等悬液材料时，可采用离心法分离。一般500～1000 r／min离心5～10min。如果悬液量大，时间可适当延长，但速度不能太大，延时也不能太长，离心速度过大、时间过长，会挤压细胞使其损伤甚至死亡。离心沉淀物用无Ca^2＋、Mg^2＋的PBS洗两次，用培养基洗一次后，调整适当细胞浓度后分瓶培养。

（2）组织块的分离方法。

对于组织块材料，由于细胞间结合紧密，为了使组织中的细胞充分分散，形成细胞悬液，可采用机械分散法、剪切分散法和消化分离法。

①机械分散法。

在采用一些纤维成分很少的组织进行培养时，可以直接用机械方法进行分散，如脑组织、部分胚胎组织以及一些肿瘤组织等。

可采用剪刀剪切、用吸管反复吹打的方式分散组织细胞，或将已充分剪碎分散的组织放在注射器内（用4～5号针）通过针头压出，或在不锈钢筛网内用钝物（常用注射器钝端）将细胞从网孔中挤压出。但此方法对组织损伤较大，而且细胞分散效果差，通常适用于处理纤维成分少的软组织，对硬组织和纤维性组织效果不好。

图1-43　机械分散法

操作方法：将组织用Hank′s液或无血清培养液漂洗，然后将其剪成5～10mm³的小块，置于80目的不锈钢筛中；把筛网放在培养皿中，用注射器针芯轻轻挤压组织，使之穿过筛网；用吸管从培养皿中吸出组织悬液，置于150目筛中用上述方法同样处理；镜检，计数过滤的细胞悬液，然后接种培养。如组织过大，可用400目筛再过滤一次。机械分散法如图1-43所示。

②剪切分散法。

在进行组织块移植培养时，可以采用剪切分散法，即将组织剪或切成1mm³左右的小块，然后分离培养。

操作方法：首先将经修整和冲洗过的组织块（大小约为1cm³）放入小烧杯中，用眼科剪反复剪切组织至糊状；用吸管吸取Hank′s液或无血清培养液加入烧杯中，轻轻吹打片刻；低速离心，去上清液，剩下的组织小块即可用于培养。为避免剪刀对组织的挤压损伤，也可以用手术刀或保险刀片交替切割组织，但操作费时，不易切割得很细。

③消化分离法。

消化分离法是把组织剪切成较小团块，利用酶的生化作用和非酶的化学作用进一步使组织松散、细胞分开，以此获得的细胞制成悬液后可直接进行培养，细胞容易贴壁生长，成活率高。各种消化试剂的作用机制各不相同，要根据组织类型和培养的具体要求选择消化方法和试剂。

a.胰蛋白酶消化法。

胰蛋白酶是目前应用最为广泛的组织消化分离试剂，适用于消化细胞间质较少的软组织，能有效地分离胚胎、上皮、肝、肾等组织，对传代培养细胞效果也较好。但对于纤维性组织和较硬的癌组织效果较差。若与胶原酶合用，就能增加对这些组织的分离作用。

胰蛋白酶的消化效果主要与胰蛋白酶的浓度、pH值、温度、组织块的大小和硬度有关。市售的胰蛋白酶，其活力都经过测定，但使用时必须新鲜配制，保存在低温冰箱中，细胞的分散直接与酶的活力有关。

一般采用的胰蛋白酶浓度为0.1%～0.5%，最常用浓度为0.25%。浓度高时对细胞有毒性，而较低浓度的胰蛋白酶在培养基中可促进细胞的增殖。Ca^2＋、Mg^2＋及血清均对胰蛋白酶活性有抑制作用。消化过程中使用的液体应不含这些离子及血清；在消化传代细胞后，可直接加含血清培养液将其灭活，而不必再用Hank′s液清洗。

8.0～9.0是胰蛋白酶活力适宜pH值范围，随着碱性的增加其活力也随之减弱，一般使用pH　8.0，这样消化后残留的胰蛋白酶溶液不会对培养液的pH值带来明显的变化。

一般认为胰蛋白酶在56℃时活性最强，但由于对细胞有损害而不能采用，以37℃为最佳，但在夏季，25℃以上对一般传代细胞也能达到消化效果。4℃时胰蛋白酶仍有缓慢的消化作用。

消化时间要根据不同情况而定，温度低、组织块大、胰蛋白酶浓度低者，消化时间长，反之则应缩短消化时间。如果细胞消化时间过长，可损害细胞的呼吸酶，从而影响细胞的代谢，一般消化时间以20min为宜。一般新鲜配制的胰蛋白酶消化力很强，所以开始使用时要注意观察。另外，有些组织和细胞比较脆弱，对胰蛋白酶的耐受性差，因而要分次消化，并及时把已消化下来的细胞与组织分开放入含有血清的培养液中，更换消化液后再继续消化。

操作方法：将组织剪成1～2mm³的小块，置于事先放置有磁性搅拌棒的三角烧瓶内，再注入3～5倍组织量的37℃的胰蛋白酶，放在磁力搅拌器上进行搅拌，速度要慢一些，一般消化20～60min。也可以放入水浴或培养箱中，每隔5～10min摇动一次。如需长时间消化，可每隔15min取出2／3上清液，移入另一离心管，冰浴，或离心后去除胰蛋白酶，收集沉淀细胞，加入含血清培养液，然后给原三角烧瓶添加新的胰蛋白酶继续消化。也可放入4℃冰箱中过夜进行消化，消化完毕后将消化液和分次收集的细胞悬液通过100目不锈钢网过滤，以除掉未充分消化的大块组织。离心去除胰蛋白酶，用Hank′s液或培养液漂洗1～2次，每次800～1000r／min离心3～5min。细胞计数后，一般按每毫升5×10⁵～1×10⁶个接种培养瓶。如果采用4℃下的冷消化，时间可长达12～24h。从冰箱取出离心后，可再添加胰蛋白酶，置于37℃培养箱中，继续温热消化20～30min，效果可能更好。

b.胶原酶法。

胶原酶是从梭状细胞芽孢杆菌提取出来的酶，对胶原有很强的消化作用，适于消化纤维性组织、上皮组织及肿瘤组织，它对细胞间质有较好的消化作用，对细胞本身影响不大，可使细胞与胶原成分脱离而不受伤害。Ca^2＋、Mg^2＋和血清成分不会影响胶原酶的消化作用，因而可用平衡盐溶液或含血清的培养液配制，这样实验操作简便并能提高细胞成活率。胶原酶的常用剂量为200U／mL或0.1～0.3mg／mL。此酶消化作用缓和，不需机械振荡，但胶原酶价格较高，大量使用将增加实验成本。

胶原酶分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型以及肝细胞专用胶原酶，要根据所要分离消化的组织类型选择胶原酶类型，如胶原酶Ⅳ型可消化胰腺，胶原酶Ⅱ型可用于消化肝、骨、甲状腺、心脏、唾液腺等组织，胶原酶Ⅲ型对哺乳动物的组织有广泛的消化作用。

操作方法：将漂洗、修剪干净的组织剪成1～2mm³的小块；将组织块放入三角烧瓶中，加入3～5倍体积的胶原酶，密封烧瓶；将烧瓶放入37℃水浴或37℃培养箱内，每隔30min振摇一次，如能放置在37℃的恒温振荡水浴箱中则更好。消化时间为1～24h，根据具体情况而定。如组织块已分散而失去块的形状，一经摇动即成细胞团或单个细胞，可以认为已消化充分。经胶原酶消化后的上皮组织，由于上皮细胞对此酶有耐受性，可能有一些细胞团未完全分散，成小团块的上皮细胞比分散的单个上皮细胞更易生长，因此，如无特殊需要可以不必进一步处理。收集消化液，以1000r／min离心5min，弃上清液。如含个别较大组织块及没有充分消化的成分，可先用100目不锈钢网过滤后，取滤液再离心，用Hank′s液或无血清培养液漂洗细胞沉淀1～2次，离心后弃上清液。加培养液制成细胞悬液，细胞计数后按常规接种细胞培养瓶。

胰蛋白酶和胶原酶生物活性的比较见表1-16。

表1-16　胰蛋白酶和胶原酶生物活性的比较

c.胰蛋白酶和EDTA联合消化法。

为了提高消化效果，有时可以采用胰蛋白酶和EDTA联合消化的方法。EDTA的作用较胰蛋白酶的作用缓和，适于消化分离传代细胞。其主要作用在于能从组织生存环境中吸取Ca^2＋、Mg^2＋，这些离子是维持组织完整的重要因素。但EDTA单独使用不能使细胞完全分离，因而常与胰蛋白酶按不同比例混合使用，效果较好。一般EDTA（0.02%）和胰蛋白酶（0.25%）混合的比例为1∶1或2∶1，其中1∶1更为常用。EDTA工作液的浓度为0.02%，用不含Ca^2＋、Mg^2＋的平衡盐溶液配制。需要特别注意的是，由于EDTA不能被血清等灭活，因而在使用EDTA消化后必须采用离心方法将其去除，否则EDTA在培养液中会改变Ca^2＋浓度，影响细胞贴壁和生长。

d.消化分离法的注意事项。

细胞消化时间和细胞类型、消化液的消化能力、细胞的密度等多种因素有关。一般培养一种新的细胞要摸索一下消化时间，掌握消化到什么程度恰到好处。新买的消化液消化能力较强，收到货后可分装成小管，按小管一次用完，其余的冻在-20℃下，以保持酶活力。消化液只需铺满瓶底即可，可放入培养箱中，另外在37℃下酶的活力高于常温下酶的活力，有利于缩短消化时间。还有一种方法，就是将胰蛋白酶铺满瓶底后，轻摇培养瓶，使胰蛋白酶与细胞充分接触，然后倒掉大部分胰蛋白酶，利用剩余的少量胰蛋白酶再消化一段时间，待细胞间空隙增大，瓶底呈花斑状即可。细胞生长到覆盖70%～80%瓶底时消化较好，若细胞密度过大，则消化后细胞易成团。

注意事项：使用EDTA处理细胞后，一定要用D-Hank′s液冲洗干净，因残留的EDTA会影响细胞生长；终止消化作用时，加入一些血清、含血清的培养液或胰蛋白酶抑制剂能终止胰蛋白酶对细胞的消化作用，血清可终止胰蛋白酶的作用，但不能终止EDTA的作用，对有些细胞来说，终止消化后的离心、冲洗是必需的；蛋白制剂不宜在4℃长期保存，切忌反复冻熔，若大包装不能较快用完，建议分装后冷冻保存；细胞消化之前用D-Hank′s液洗两遍，使瓶内没有血清，减少对胰蛋白酶的中和作用，效果会好一些。

胰蛋白酶和胶原酶在不同温度下消化各种组织小块所需时间见表1-17。

表1-17　胰蛋白酶和胶原酶在不同温度下消化各种组织小块所需时间（单位：h）

二、原代培养方法

原代培养也是建立各种细胞系（株）必经的阶段。通过一定的选择或纯化方法，从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质的细胞称为细胞株。假如原代培养能够维持几小时甚至更长时间，即可进行进一步筛选。有的细胞具有继续增殖的能力，有的细胞只是存活而不增殖，而另外一些细胞只是在特殊条件下应用而不存活，因而细胞类型的分布将会改变。

原代培养是获取细胞的主要手段，但原代培养的细胞部分生物学特征尚不稳定，细胞成分多且比较复杂，即使生长出同一类型细胞如成纤维细胞或上皮细胞，细胞间也存在很大差异。如果供体不同，即使组织类型、部位相同，个体间也存在很大差异。如要做较为严格的对比性实验研究，还需对细胞进行短期传代后再进行。

原代培养方法很多，最基本和常用的有两种，即组织块培养法和消化培养法。

（一）组织块培养法

组织块培养法是常用的、简便易行且成功率较高的原代培养方法。其基本方法是将组织剪切成小块后，接种于培养瓶中。培养瓶可根据不同细胞生长的需要作适当处理。例如，预先涂以胶原薄层，以利于组织块黏着于瓶壁，使周边细胞能沿瓶壁向外生长。如果原代细胞准备用于组织染色、电镜等检查，可在做原代培养前先在培养瓶内放置小盖玻片，并在放入组织块前预先用1～2滴培养液润湿瓶底，使之固定，小盖玻片要清洗干净，在消毒前放置。组织块培养法操作简便，部分种类的组织细胞在小块贴壁培养24h后，细胞就从组织块四周游出，然后逐渐延伸，长成肉眼可以观察到的生长晕，5～7d后组织块中央的组织细胞逐渐坏死脱落和发生漂浮，此漂浮小块可随换液而弃去。但由于在反复剪切和接种过程中对组织块的损伤，并不是每个小块都能长出细胞。组织块培养法特别适合于组织量少的原代培养，但组织块培养时细胞生长较慢，耗时较长。

1.操作方法

（1）按照前述培养细胞取材的基本原则和方法取材、修剪，将组织剪或切成1mm³左右的小块。在剪切过程中，可以适当向组织上滴加1～2滴培养液，以保持湿润。

（2）将剪切好的组织小块，用眼科镊送入培养瓶中。用牙科探针或弯头吸管将组织块均匀摆在瓶壁上，每小块间距0.2～0.5cm。一般以25mL培养瓶（底面积约为17.5 cm²）放置20～30个组织小块为宜，如果瓶内有盖玻片，其上也放置几块。将组织块放置好后，轻轻将培养瓶翻转过来，将适量培养液加到非细胞生长面上，注意翻瓶时勿令组织小块流动，盖好瓶盖，将培养瓶倾斜放置在37℃培养箱内。

（3）放置2～4h，待组织小块贴附后，将培养瓶缓慢翻转平放，让液体缓缓覆盖组织小块，静置培养。动作要轻巧，严禁摇动和来回振荡，以防动作过快使贴附的组织块受液体冲击而漂起造成原代培养失败。若组织块不易贴壁，可预先在瓶底壁涂薄层血清、胎汁或鼠尾胶原等。

组织块培养也可不用翻转法，即在摆放组织块后，向培养瓶内仅加入少量培养液，以能保持组织块湿润即可。盖好瓶盖，放入培养箱中培养24h再补加培养液。

组织块原代培养如图1-44所示。

图1-44　组织块原代培养

2.注意事项

开始培养时培养基不宜多，以保持组织块湿润即可，培养24h后再补液。组织块接种后1～3d，由于游出细胞数很少，组织块的贴附不牢固，在观察和移动过程中要注意动作轻巧，以利于贴壁和生长，尽量不要引起液体的振荡而产生对组织块的冲击力使其漂起。在原代培养的1～2d内，要特别注意观察是否有细菌、霉菌的污染，一旦发现，要及时清除，以防给培养箱内的其他细胞带来污染。

对原代培养要及时观察，发现细胞游出后要照相记录。原代培养3～5d时可换液，一方面补充营养，另一方面去除漂浮的组织块和残留的血细胞，因为已漂浮的组织块和很多细胞碎片含有有害物质，影响原代细胞的生长，要及时清除。

（二）消化培养法

消化培养法是采用前述的组织消化分离法将妨碍细胞生长的细胞间质（包括基质、纤维等）去除，使细胞分散，形成悬液，然后分瓶培养。本方法适用于培养大量组织，原代细胞产量高，但操作烦琐、易污染，一些消化酶价格昂贵，实验成本高。

操作方法如下。

（1）按消化分离法收获细胞。

（2）在消化过程中，可随时吸取少量消化液在镜下观察，如发现组织已分散成细胞团或单个细胞，则终止消化。通过200目的筛网，滤掉组织块。大组织块可加入新的消化液继续消化。

（3）将已过滤的消化液800～1000r／min离心5min后，去除上清液，加含血清培养液，轻轻吹打形成细胞悬液。如果用胶原酶或EDTA消化液等，还要用Hank′s液或培养液洗1～2次后再加培养液，细胞计数后，接种于培养瓶，置于5%CO₂培养箱中培养。

（三）器官培养

器官培养是指从供体取得器官或器官组织块后，不进行组织分离而直接在体外的特定环境条件下培养，其特性是仍保持原有器官的组织结构和联系，并能存活。器官培养的目的和技术与单层细胞培养的不同，可利用器官培养对器官组织的生长、变化进行体外观察。器官培养主要强调器官组织的相对完整性，重点观察细胞在正常联系和排列情况下，相互之间的影响和局部环境的生物调节作用等。

器官培养可提供正常发育、生长、分化及外部因子对这些功能的影响等方面的重要信息。器官培养中的组织比细胞培养中的组织能更好地成为生理实验模型。通常，体外实验比活体实验能更快地获得结果，而且如有必要还可定量。实验已证实，在重复实验中，器官培养的定量结果既可重复又可靠。

1.器官培养的要求

（1）由于体外组织没有血液系统供给养分，维持组织细胞生长需要的营养和氧气仅靠自然渗透来维持，为使器官组织生长正常，确保中心不发生营养缺乏性坏死，器官组织的厚度或直径不宜超过1mm。

（2）器官组织内部细胞需要有足够的氧气渗入。常采用以下两种方法：一是将器官组织块放置在培养基气液界面，以利于气体交换；二是提高培养环境的氧分压，要根据组织类型而定，多数组织需较高氧分压，一般要加注纯氧，提高氧分压时，仍然需保持5%的CO₂，以维持培养液的pH值。

2.操作方法

（1）将不锈钢网做成支架形状，放置于培养皿中，高度为4mm或调整至培养皿的1／2深度平面，在其表面放置0.5μm孔径的滤膜。

（2）将培养液加入培养皿中，使液面刚刚接触到滤膜，但不要使其浮起。

（3）将要培养的器官组织平放在滤膜上，厚度应为200～1000μm，水平面积不超过10mm²，如组织为肝、肾等，不能大于1mm³。

（4）将上述准备好的培养物放入CO₂培养箱中，并加注氧气，调整氧分压，最好达到90%。

（5）培养过程中要注意观察培养液液面，尽可能保持在与滤膜一致的水平上。不同的器官培养，尚需一些特殊的条件，如某些生长因子、激素等。

（6）上述器官培养1～3周，每2～3d换液一次，并根据情况做进一步实验和检测。

培养完成后的器官组织小块，可以取下直接进行石蜡包埋、冷冻切片或连同微孔滤膜一起进行组织学研究，也可以分割传代继续培养或进行体内移植实验。

三、原代细胞的培养要求

（一）贴壁细胞的培养要求

（1）凡经消化液处理的实体组织来源的细胞要经过充分漂洗，以除去消化液的毒性。

（2）细胞接种时浓度要稍大一些，至少为5×10⁸个／L。若原代贴壁细胞不是用于长期培养，只是用于分离繁殖或测定病毒，其细胞浓度可以加大，尽量贴成厚层以利于提高病毒的效价和使测定结果更加明显、准确。

（3）培养基可用DMEM。

（4）小牛血清浓度为10%～20%。

（5）创造适宜的培养环境，应在37℃、5%CO₂培养箱中培养。

（6）在起始的2d中保持静止，以防止刚贴壁的细胞发生脱落、漂浮。

（7）待细胞贴壁伸展并逐渐形成网状，此时的pH值若有明显变化，应将原代细胞换液，倒去旧液，换入新鲜的培养基，以便除去衰老、死亡的细胞和陈旧的培养基，使贴壁细胞能获得充足的营养。

（二）悬浮细胞的培养要求

（1）凡来自于胸水、腹水、羊水的组织材料，在原代培养时要尽量去除红细胞。

（2）若为用于实验的短期培养，可在含10%小牛血清的培养基中进行。

（3）细胞浓度可在5×10⁹～8×10⁹个／L范围内，然后进行分瓶培养。

（4）一般待细胞开始增殖甚至结成小团块时，培养基中pH值变小，说明细胞生长繁殖良好，每隔3d需半量换液一次。

（5）一般待细胞增殖加快，浓度明显增加，pH值发生明显变化时，可考虑传代。

四、原代细胞的维持

（一）贴壁细胞的维持

贴壁细胞长成网状或基本单层时，由于营养缺乏，代谢产物增多，pH值变小，不适宜细胞生长，此时细胞还未长成单层，未达到饱和密度，仍需继续培养，因此，需采取换液方式来更新营养成分以满足细胞继续生长繁殖的需要。弃去旧液，加入与原培养基相同的等量培养液。若希望细胞在较长时间内维持存活，但不需增殖，则此时要换成含2%小牛血清的维持液。

（二）悬浮细胞的维持

凡经培养后只在细胞培养液中悬浮生长而不贴壁的细胞，需在倒置显微镜下方可观察到细胞的形态和生长现象，细胞发生分裂繁殖，此时培养液中的营养成分并不能维持细胞的营养需求，加之代谢产物增多，pH值变小，细胞不适宜生长，需进行换液。换液时，只能采用半量换液的方式，千万不能采取倒去旧液加入新液的方式进行换液。

知识拓展

上海长征医院完成神经干细胞的纯化分离与原代培养

上海长征医院神经外科目前已完成神经干细胞的纯化分离与原代培养，使我国在该领域的研究取得了重大突破。

他们借鉴国内外胚胎干细胞、造血干细胞研究的经验，创造性地利用先进的免疫磁珠细胞分选系统，对胚胎大鼠脑组织中的神经干细胞进行多次分离纯化、收集，终于获得纯度为93%～99%的神经干细胞。经培养的细胞生长状态良好，完全适合进行传代扩增培养及细胞移植研究。

对神经干细胞进行研究，可以明确其存在部位、生长条件、分化特性，这是神经科学研究的国际性热点课题。这一研究成果一旦用于临床，可以通过神经干细胞移植修复因脑损伤或脑出血、脑缺血引起的神经组织的损伤，恢复相应的神经功能。

思考题

1.试述皮肤和黏膜的取材方法。

2.如何进行细胞悬液的分离？

3.贴壁细胞的维持方法是什么？

4.器官培养的要求有哪些？

5.简述贴壁细胞的培养要求。

6.试述组织块培养法的操作过程。

7.简述鼠胚组织的取材方法。