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细胞培养的方法和步骤

时间:2022-10-20 百科知识 版权反馈
【摘要】:原代细胞培养是从事细胞培养工作最基本的技术,根据不同的实验目的及实验材料,解离或分离的方法和条件各不同。下面以胰蛋白酶消化法原代培养初生乳鼠肺组织为例加以说明。细胞计数与活力测定方法见第3章第二节。随后逐渐出现细胞分裂,细胞数量增多。可根据培养液颜色变化,补加和更换培养液,同时注意吸除漂浮的组织块。为了维持细胞的存活与生长,必须将原代培养瓶内细胞分离、稀释接种到新的培养瓶内继续扩大培养即传代培养。
细胞培养的方法_组织工程学实验技


细胞培养可分为原代培养和传代培养。从供体获取组织细胞的首次培养叫原代培养(primary culture)。原代细胞离体时间短,具有二倍体遗传性,在一定程度上反映了体内生长的特性,很适合作药物测试、细胞分化等实验研究。当培养的细胞增殖达到一定的密度后,则需要做再培养,即将培养的细胞分散后,从一个容器以1∶2或其他比率转移到另一个容器中扩大培养,为传代培养(passage culture)。传代培养的次数就是细胞的代数。

一、原代细胞培养

原代细胞培养是从事细胞培养工作最基本的技术,根据不同的实验目的及实验材料,解离或分离的方法和条件各不同。一般常用方法有二:组织块培养法及单层细胞培养法。

(一)单层细胞培养法

【实验用品】

1.器材 超净工作台、CO2培养箱、普通显微镜、倒置相差显微镜、水浴箱、离心机、解剖剪、解剖镊、眼科剪、培养皿、培养瓶、离心管、吸管、移液管、血细胞计数板、橡皮吸头、筛网、酒精灯、试管架、酒精瓶、棉球、无菌服、口罩、帽子等。

2.试剂 RPMI-1640培养液(含小牛血清和青霉素、链霉素)、0.25%胰蛋白酶消化液、Hanks液。

3.材料 新生乳鼠。

所有组织都含有一定量的细胞间质(纤维、基质等),妨碍细胞生长。用酶消化后,能除去间质,使组织容易分离成单个细胞或较小的细胞团,接种后细胞易于生长。下面以胰蛋白酶消化法原代培养初生乳鼠肺组织为例加以说明。

【操作步骤】

1.取材 取新生乳鼠1只,断髓处死,将尾巴提起,鼠身浸入装有75%乙醇的烧杯中3s,取出放置在灭菌的培养皿中移入工作台内。无菌操作取材。用碘酒、75%乙醇消毒胸廓部位皮肤。在胸廓正中线中位处,用弯头眼科镊夹起腹部皮肤,剪开腹腔和胸腔,并剪去部分胸壁以充分暴露胸腔,用眼科镊轻轻夹起粉红色肺组织并剪下放入另一培养皿中。用Hanks液清洗,去掉血污。

2.消化与分散组织块 把组织块移入无菌的青霉素瓶中并置于一角,用眼科直剪反复剪切组织成1mm3大小的小块,此过程需15min,再用Hanks液洗涤2或3次,至液体澄清方可。弃去Hanks液,加入5~10倍体积的0.25%胰蛋白酶溶液(pH7.4~7.8),盖好橡皮塞,置37℃水浴中消化20~30min,消化时每隔5min摇动一次,使组织块散开。视组织块变得疏松颜色略变白时,从水浴中取出,在超净工作台中用吸管轻轻吸去消化液,加入2~3ml完全培养基(血清中含有胰蛋白酶抑制剂),以终止消化。然后用吸管反复吹打,使大部分组织块分散成细胞团或单个细胞状态,静置片刻,让未被消化完的组织自然下沉,然后将上层细胞悬液移入无菌离心管中备用。也可使细胞悬液通过筛网,以去除细胞混悬液中的细胞团,收集过筛网的单细胞悬液。

3.细胞计数与活力测定 离心管平衡后以800g离心5min,弃去上清液,加入适量培养液,用吸管反复吹打混匀后取样计数和进行活率测定。细胞计数与活力测定方法见第3章第二节。

4.接种培养 在培养瓶的侧面做好标记:培养物的名称、组号和日期。接种时,在25ml培养瓶中先加入1.5ml培养液,再接种1ml细胞悬液,用吸管轻轻混匀细胞后加盖瓶塞。持瓶做上下、左右十字形晃动后,移入37℃、5%CO2培养箱中开放培养。接种细胞数与细胞类型、活力有关,单层细胞培养接种浓度一般为1×105~1×106/ml细胞悬液。细胞活力好的,细胞接种数可少一些;胚胎细胞接种数较少,而分化程度高的二倍体细胞接种浓度要高些。

(二)组织块培养法

组织块培养是常用的简便易行和成功率较高的原代培养方法。把组织块切割成0.5~1mm3的小块后,由于组织块体积很小,在不加任何黏着剂的情况下,它们也能贴附于瓶壁上,然后细胞自组织块边缘向外长出生长晕,最后连接成片形成单层细胞。

【实验用品】 同(一)单层细胞培养法。

【操作步骤】

1.取材 从动物体内取材方法与单层细胞培养取材相同。将取出的组织(肝、肾或肺)移入无菌的培养皿中,用Hanks液冲洗,去除血污。把组织块移入无菌的青霉素瓶中并置于一角,用眼科直剪反复剪切组织成0.5~1mm3的小块,再用吸管加2或3滴细胞培养液,用吸管轻轻吹打,使组织块悬浮在培养液中。

2.接种培养 用吸管分次吸取组织块悬液,吸取时注意让组织块吸在吸管端部,以免吸得过高,黏附管壁而丢失。将组织块均匀排在培养瓶底壁上,翻转培养瓶,加入2~3ml培养液,塞紧瓶塞,做好标记置于37℃培养箱中2~3h后,待组织块略干燥能牢固贴于瓶壁上时,再缓慢地将培养瓶翻转,使培养液浸泡组织块,继续静止培养。

3.观察 静止培养2~3d后,每天小心取出培养瓶置于倒置相关显微镜下观察,已贴壁的组织块边缘有细胞长出。随后逐渐出现细胞分裂,细胞数量增多。可根据培养液颜色变化,补加和更换培养液,同时注意吸除漂浮的组织块。细胞生长良好时,10~15d可长成致密单层,这时可进行传代培养。

二、细胞传代培养

代培养细胞在瓶壁汇合后,需进行分离再培养,否则正常细胞因生存空间不足或细胞密度过大,致营养不足而引起细胞衰老、停止生长甚至死亡。为了维持细胞的存活与生长,必须将原代培养瓶内细胞分离、稀释接种到新的培养瓶内继续扩大培养即传代培养。贴附型细胞与悬浮型细胞传代方式不同:贴附型细胞用酶消化方法传代,而悬浮型细胞可直接或离心传代。

【实验用品】

1.器材 普通显微镜、倒置相差显微镜、培养瓶、离心管、吸管、移液管、橡皮吸头、酒精灯、试管架、乙醇瓶、棉球等。

2.试剂 RPMI-1640培养液(含小牛血清和青、链霉素)、0.25%胰蛋白酶消化液、Hanks液。

3.材料 原代培养的乳鼠肺细胞。

【操作步骤】

1.贴壁细胞的传代

(1)洗细胞:取已生长成致密单层的乳鼠原代培养肺细胞,倒去培养液,加入2~3ml Hanks液,轻轻振荡漂洗细胞后倾去,以去除残留的血清和衰老脱落的细胞及其碎片。

(2)消化:加入适量胰蛋白酶消化液浸泡细胞表面,倒置相差显微镜下观察细胞,当大部分细胞变成圆球形、细胞成片收缩、细胞间隙增大时可倒去消化液,加基础培养液或Hanks 1ml终止消化,用吸管有序地吹打瓶壁细胞,将消化下来的细胞于离心管中800g离心5min以去除酶液。

(3)接种:离心沉淀细胞后加海里完全培养液,混匀,分别接种到2~3个新的培养瓶内。每瓶补加培养液至5ml,37℃、5%CO2培养箱中培养。

注意事项:消化液作用多层细胞时,镜下出现蜘蛛网状时,立即终止消化;加消化液后,若2min内出现细胞脱落时,示消化过头;消化过程中见大片细胞脱落,示消化过头;消化过头时切勿倒去多余消化液,需加入等量的培养液吹打。

2.悬浮细胞的传代

(1)直接传代:让悬浮细胞慢慢沉淀在瓶底后,将上清液吸掉1/3~1/2,用吸管吹打形成细胞悬液后,再传代。

(2)离心传代:在超净工作台内用吸管将培养瓶中的细胞吹打均匀,尤其是将那些半贴壁的细胞吹打起来;吸入离心管中,盖紧盖子,与另一离心管平衡后800g离心5min;回到超净工作台内,弃去上清液,加入适量新培养液,用吸管打匀,制成悬液后接种培养。

(3)若只为了保留细胞,则吸取少量细胞悬液至另一瓶中,加入适量新培养液即可,不必经离心步骤。

三、细胞的冻存与复苏

长期传代的细胞在暂时不用时可以用低温冷冻的方法保存,复苏后仍然可保持其原有的生物学特性和增殖活性。

【实验用品】

1.器材 同细胞培养,液氮罐,无菌细胞冻存管。

2.试剂 二甲基亚砜(dimathyl sulfoxide,DMSO),培养液、小牛血清、0.25%胰蛋白酶消化液。

3.材料 培养的HeLa细胞株。

【操作步骤】

1.细胞冻存

(1)选对数生长期细胞(必须证明无支原体污染),在收集细胞前24h换液1次。

(2)按前述方法将培养细胞制成细胞悬液,计数使细胞达5×106/ml左右密度,离心去上清,用1ml完全培养基重悬细胞,分装2个无菌管。

(3)用含20%小牛血清的培养液配制的20%DMSO冻存液,按与细胞悬液相同的量(0.5ml)一滴一滴地加入细胞无菌细胞冻存管中(DMSO的终浓度为10%),然后用吸管轻轻吹打令细胞悬浮。

(4)将冻存管置入纱布袋中,标明细胞名称和冻存日期。

(5)将细胞冻存管置4℃冰箱30min→-20℃冰箱30min→-70℃冰箱30min→液氮表面过夜,最后投入液氮中。

2.细胞复苏

(1)从液氮罐中取出细胞冻存管,迅速放入37℃水浴1~2min,使之融化。

(2)用70%乙醇消毒管中后,用吸管吸收细胞悬液,注入离心管中再滴加5~10ml基础培养液。

(3)800g,离心5min,弃上清,加入完全培养基后装入培养瓶,37℃、5%CO2培养箱中常规培养。

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