抗生素发酵技术

抗生素发酵技术_生物工艺学实验指

综合实验八　抗生素发酵技术

一、背景知识

（一）抗生素的历史

抗生素（Antibiotic）是20世纪的重要发明之一。由于早期发现的抗生素（如青霉素、链霉素等）均来自微生物的生命活动，而且主要应用于细菌感染的疾病防治，因此它一度被认为是微生物在新陈代谢过程中产生，具有抑制他种微生物生长及活动，甚至杀死他种微生物的一种化学物质。但随着抗生素工业的发展，抗生素的来源从微生物拓展到植物及动物，如从植物中提取的黄连素等。抗生素的应用也远远超出了抗菌范围，它们被应用于抗肿瘤、抗虫等。因此，目前比较确切的抗生素定义应为：“抗生素是生物，包括微生物、植物和动物在内，在其生命活动过程中所产生的（或由其他方法获得的），能在低微浓度下有选择地抑制或影响他种生物功能的有机物质。”

抗生素学科的发展是劳动人民长期以来与疾病进行斗争的结果，也是随着人类对自然界中微生物的相互作用，尤其是对微生物之间的拮抗现象的研究而发展起来的。早在《左传》中就有记载说：“叔展曰：有麦曲乎？曰：无。……河豚腹疾奈何？”该记载表明，用麦曲可以治疗消化系统的疾病。欧洲、南美洲等地，在数世纪前也曾用发霉的面包、旧鞋、玉蜀黍等来治疗溃疡、肠道感染、化脓疮伤等疾病。因此用微生物产物治疗疾病很早就有记载，只是那时不知其原理。到了19世纪70年代，法国的Pasteur发现某些微生物对炭疽杆菌有抑制作用。他提出了利用一种微生物抑制另一种微生物的原理来治疗一些由于感染而产生的疾病，并报道了微生物之间的拮抗现象。1928年，英国细菌学家Fleming发现，在培养葡萄球菌的双碟上感染了一株霉菌，它能杀死周围的葡萄球菌。他将此霉菌分离纯化后，经鉴定为点青霉，并将该菌产生的物质命名为青霉素。但因为受到当时科学思想的阻碍，即认为动物试验结果不能反映人体内发生的情况，或者说以动物试验结果来指导人的医学实践是不可靠的。Fleming发现的青霉素被埋没了10年。在这10年中，青霉素的应用仅作为一种选择培养基的组分来培养百日咳杆菌。

进一步推动抗生素发展的是英国的Florey和Chain。1940年，他们进一步研究此菌，从该菌培养液中获得了青霉素的提取物，并对它的某些特性进行了报告，由此开创了抗生素时代。经实验和临床试验证明，青霉素毒性很小，并对一些革兰氏阳性菌引起的一些疾病有较好的疗效。青霉素的发现，使感染性疾病的治疗发生了巨大的变革。青霉素成为第一个作为治疗药物应用于临床的抗生素。在此基础上，新兴抗生素工业开始发展，链霉素（1941）、金霉素（1947）、氯霉素（1948）、土霉素（1950）、制霉菌素（1950）等品种相继被发现并投产。

20世纪50年代起，许多国家开始致力于农用抗生素的研究。如杀稻瘟素（Blasticidin A）、春日霉素（kasugamycin）、灭瘟素S、井冈霉素等高效低毒的农用抗生素相继出现。20世纪70年代以来，抗生素品种飞跃发展。到目前为止，从自然界发现和分离了4300多种抗生素。通过化学结构的改造，共制备了约三万余种半合成抗生素。目前世界各国实际生产和应用于医疗的抗生素约120多种，连同各种半合成抗生素衍生物及盐类约350余种。其中以青霉素类、头孢菌素类、四环素类、氨基糖苷类及大环内酯类为最常用。

（二）抗生素的发酵工艺与种类

1.抗生素的发酵工艺

菌种→孢子制备→种子制备→发酵→发酵液预处理→提取及精制→成品包装

（1）菌种

从土壤等自然环境中筛选获得能产生抗生素的微生物，经过纯化、选育后得到菌种。以放线菌为例，菌种保存可采用砂土管法或冻干法处理孢子，长期保存。一般生产用菌株经多次移植往往会发生变异而退化，故必须经常进行菌种选育和纯化以提高其生产能力。

（2）孢子制备

生产用的菌株须经纯化和生产能力的检验，若符合规定，才能用来制备种子。制备孢子时，将保藏的处于休眠状态的孢子接种到灭菌过的固体斜面培养基上，在一定温度下培养5～7d或7d以上。为获得更多数量的孢子以供生产需要，必要时可在固体培养基上扩大培养。

（3）种子制备

其目的是使孢子萌发、生长繁殖以获得足够数量的菌丝，后再逐级扩大培养。种子扩大培养级数的多少，决定于菌种的性质、生产规模的大小和生产工艺的特点。扩大培养级数通常为二级。摇瓶培养是在锥形瓶内装入一定数量的液体培养基，灭菌后以无菌操作接入孢子，放在摇床上恒温培养。在一级种子罐中培养时，接种材料为孢子悬浮液或摇瓶的菌丝，接种量一般为1%～5%。从一级种子罐接入二级种子罐接种量一般为5%～20%。在罐内培养过程中，需要搅拌和通入无菌空气，控制罐温、罐压，并定时取样作无菌试验，观察菌丝形态，测定发酵单位和进行生化分析等，并观察是否有杂菌情况。

（4）培养基的配制

在抗生素发酵生产中，各菌种的特性不一样，采用的工艺不同，所需的培养基组成亦有差异。同一菌种，在不同发酵阶段，其营养要求也不完全一样。因此需根据要求来调整培养基的成分与配比。其主要成分包括碳源、氮源、无机盐类和前体等。

①碳源。

主要用以供给菌种生命活动所需的能量，构成菌体细胞及代谢产物。常用碳源包括淀粉、葡萄糖和油脂类。使用葡萄糖为碳源时，可采用流加工工艺，有利于提高抗生素产量。

②氮源。

主要用以构成菌体细胞物质（包括氨基酸、蛋白质、核酸）和含氮代谢物。常见的有机氮源有黄豆饼粉、花生饼粉、棉籽饼粉、玉米浆、蛋白胨、尿素、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉。常见的无机氮源包括氨水、硫酸铵、硝酸盐和磷酸氢二氨等。放线菌在含有机氮源的培养基中菌丝生长速度较快，菌丝量也较多。

③无机盐和微量元素。

抗生素产生菌和其他微生物一样，在生长、繁殖和产生生物产品的过程中，需要某些无机盐类和微量元素。如硫、磷、镁、铁、钾、钠、锌、铜、钴、锰等，其浓度对菌种的生理活性有一定影响。因此，应选择合适的配比和浓度。此外，在发酵过程中可加入碳酸钙作为缓冲剂以调节pH。

④前体。

在抗生素生物合成中，抗生素生产菌可利用前体物质构成抗生素分子中的一部分而其本身又没有显著改变。前体除直接参与抗生素生物合成外，在一定条件下还能控制菌体合成抗生素的方向并增加抗生素的产量。如苯乙酸、成苯乙酰胺可作为青霉素发酵的前体。丙醇或丙酸可作为红毒素发酵的前体。此外，有时还需根据抗生素的合成途径加入某种促进剂或抑制剂，如在四环素发酵中加入M-促进剂和抑制剂溴化钠，以抑制金霉素的生物合成并增加四环素的产量。

⑤培养基的质量。

培养基的质量应予严格控制，以保证发酵水平。可以通过化学分析，并在必要时作摇瓶试验以控制其质量。同时需注意培养基的灭菌温度和时间，若温度过高、受热时间过长亦能引起培养基成分的降解或变质。

（5）发酵

发酵的目的是使微生物大量增殖并分泌所需的抗生素。发酵接种量一般为10%或10%以上。在整个发酵过程中，需不断通无菌空气并搅拌，以维持一定罐压或溶氧，在罐的夹层或蛇形管中需通冷却水以维持一定罐温。同时，要加入消泡剂或安装消泡装置以控制泡沫，加入酸、碱以调节发酵液的pH。有的品种在发酵过程中还需加入葡萄糖、铵盐或前体，以促进抗生素的产生。

（6）发酵液的预处理和过滤

发酵液的过滤和预处理的目的不仅在于分离菌丝，还需将一些杂质除去。

①发酵液的预处理。

发酵液中的杂质如高价无机离子（Ca2＋、mg2＋、Fe3＋）和蛋白质会对抗生素的分离纯化影响较大，如离子交换的过程中不利于树脂对抗生素的吸附。

对高价离子的去除，可采用草酸或磷酸。如加草酸，则它与钙离子生成的草酸钙还能促使蛋白质凝固以提高发酵滤液的质量；如加磷酸（或磷酸盐），则既能降低钙离子浓度，也易于去除镁离子。

对于蛋白质，可利用等电点沉淀的方法将其去除。蛋白质一般以胶体状态存在于发酵液中，属于两性物质，在酸性溶液中带正电荷，在碱性溶液中带负电荷，而在某一pH下，净电荷为零，溶解度最小。利用蛋白质这一特性，将其从发酵液中去除。

对热稳定的抗生素发酵液还可用加热法预处理。使蛋白质变性、发酵液黏度降低、加快滤速。

②发酵液的过滤。

含有抗生素产生菌的发酵液一般为非牛顿型液体、很难过滤。一般采用鼓式真空过滤机实现连续过滤操作。为加强过滤效果，可在转鼓表层涂以助滤剂硅藻土。当转鼓旋转到卸渣区时，过滤机上的刮刀会将助滤剂及菌体层刮去，以使过滤面不断更新，达到连续过滤的目的。

（7）抗生素的提取

提取的目的是制取高纯度的符合药典规定的抗生素成品。由于多数抗生素不稳定，故整个提取过程要求时间短、温度低、pH宜选择对抗生素较稳定的范围。

常用的抗生素提取方法包括溶媒萃取法、离子交换法和沉淀法等。

（8）抗生素的精制

这是抗生素生产的最后工序。对产品进行精制、烘干和包装的阶段要符合《药品生产质量管理规范》（GMP）的规定。

2.抗生素的种类

自1940年以来，已发现的抗生素种类达几千种，但在临床上能应用的仅几百种。随着新抗生素的不断涌现，需要将抗生素进行分类，以便于研究。现将常见的分类方法列述如下。

（1）根据抗生素的生物来源分类

微生物是产生抗生素的主要来源，其中以放线菌产生的为最多，真菌次之，细菌再次之，而来源于动植物的较少。

①放线菌产生的抗生素。

在所有已发现的抗生素中，由它产生的抗生素占一半以上。其中又以链霉菌属产生的抗生素为最多，诺卡氏菌属、小单孢菌属次之。放线菌产生的抗生素主要有氨基糖苷类（如链霉素）、四环类（如四环素）、大环内酯类（如红霉素）、多烯类（如制霉菌素）、放线菌素类（如放线菌素D）等。

②真菌产生的抗生素。

在真菌的四个纲中，不完全菌纲的青霉菌属和头孢菌属的微生物能分泌一些重要的抗生素，如青霉素、头孢菌素。其次为担子菌纲，藻菌纲和子囊菌纲产生的抗生素种类很少。

③细菌产生的抗生素。

能产生抗生素的细菌主要有多黏杆菌、枯草杆菌、芽孢杆菌等。如由多黏杆菌产生的多黏菌素等。

④植物或动物产生的抗生素。

由植物或动物产生的抗生素较少，如从大蒜中可提取得到蒜素，从动物脏器中能提取得到鱼素等。

（2）根据抗生素的作用分类

按照抗生素的作用，可以分为6个类别：

①广谱抗生素。如氨苄青霉素，它既能抑制革兰氏阳性菌，又能抑制革兰氏阴性菌。

②抗革兰氏阳性菌的抗生素。如青霉素等。

③抗革兰氏阴性菌的抗生素。如链霉素等。

④抗真菌抗生素。如制霉菌素等。

⑤抗病毒抗生素。如四环类抗生素，它对立克次体及较大病毒有一定作用。

⑥抗癌抗生素。如阿霉素等。

（3）根据抗生素的化学结构分类

由于化学结构决定抗生素的理化性质、作用机制和疗效，故按此法分类具有重大意义。但是，许多抗生素的结构复杂，而且有些抗生素的分子中还含有几种结构。故按此法分类时，不仅应考虑其整个化学结构，还应着重考虑其活性部分的化学构造，现按习惯法分类如下：

①β-内酰胺类抗生素。包括青霉素类、头孢菌素类等，它们都包含一个四元内酰胺环。

②氨基糖苷类抗生素。包括链霉素、庆大霉素等，它们既含有氨基糖苷，也含有氨基环醇的结构。

③大环内酯类抗生素。如红霉素、麦迪霉素（Medicamycin），它们含有一个大环内酯作配糖体，以苷健和1～3个分子的糖相连。

④四环类抗生素。如四环素、土霉素等，它们以四并苯为母核。

⑤多肽类抗生素。如多黏菌素、杆菌肽等，它们多由细菌特别是由产孢子的杆菌产生，并含有多种氨基酸，经肽键缩合成线状、环状或带侧链的环状多肽。

（4）根据抗生素的作用机制分类

根据抗生素对致病菌作用的机制，可分成五类：

①抑制细胞壁合成的抗生素。如青霉素、头孢菌素。

②影响细胞膜功能的抗生素。如多烯类抗生素。

③抑制蛋白质合成的抗生素。如四环素。

④抑制核酸合成的抗生素。如影响DNA结构和功能的丝裂霉素C。

⑤抑制生物能作用的抗生素。如抑制电子转移的抗霉素。

（5）根据抗生素的生物合成途径分类

①氨基酸、肽类衍生物。如青霉素、头孢菌素等寡肽抗生素。

②糖类衍生物。如链霉素糖苷类抗生素。

③乙酸、丙酸衍生物。如红霉素等丙酸衍生物。

（三）抗生素的作用机理

抗生素等抗菌剂的抑菌或杀菌作用，主要是针对“细菌有而人（或其他高等动植物）没有”的机制进行杀伤。主要有4大类作用机理，分别是抑制核酸合成、蛋白质合成、改变细胞膜的透性和干扰细胞壁的合成。此外，还可以通过作用于细胞内阳离子、抑制能量代谢等机制达到抗菌的效果。

（四）抗生素的应用

1.抗生素在医疗上的应用

抗生素在临床治疗中占有重要地位。自发现抗生素并将其应用于临床上以来，很多感染性疾病的死亡率大幅度下降。但抗生素如使用不当，会带来许多不良后果，例如细菌耐药性逐渐普遍、产生过敏反应和由于体内菌群失调而引起的双重感染等。因此，应严防滥用，要严格掌握抗生素的适应症和剂量，并注意用药时的配伍禁忌。

2.抗生素在农牧业中的应用

不少农用抗生素作用强、剂量小，且不易引起环境污染，故受到欢迎。如春日霉素（Kasugamycin）对防治稻瘟病很有效。在畜牧业中可用以治疗和预防牲畜的疾病，以及作为幼畜、幼禽的生长刺激剂。在兽医临床上已使用的抗生素有四环类、杆菌肽等。

（五）抗生素的发展

1.我国抗生素的发展

我国抗生素类药物应用极其广泛，抗生素原料药企业的产能和产量已达世界第一。在2007年，我国抗生素原料药销售收入超过350亿元人民币，出口约为22亿美元，占所有原料药出口总额的25%。其中，半合成和头孢类抗生素占全球市场份额的50%以上。6-氨苄青霉素、烷酸（APA）、土霉素、阿莫西林和头孢类中间体与原料药等总量过万吨，青霉素工业盐潜在产能接近10万吨，市场集中度达80%。

国内抗生素生产企业积极参与国外高端规范市场的认证。认证范围涵盖产品质量、环保、职业健康安全等。企业仿中有创，在工艺创新上有长足发展，原料药生产从低端价值向高端价值攀升，不断提高企业的综合竞争优势。同时我国企业还积极在技术、工艺、管理和市场营销等方面与知名跨国药企展开合作。

2.国际抗生素的发展现状

现在，抗生素类药物应用越来越广泛，抗生素进入了全盛时代。国际抗生素市场的平均年增长率在8%左右，抗生素市场份额为250～260亿美元。各种药企业纷纷投入巨资进行抗生素药物的研发，使抗生素新品不断涌现。国外通过抗生素生物合成基因的克隆来提高抗生素产量，也是近年来研究领域的热点。

二、实验简介

本实验分为两部分，第一部分为利用细菌发酵生产抗生素实验，第二部分为利用放线菌发酵生产抗生素实验。通过这两部分内容的学习和实践，可为今后从事抗生素的工业发酵生产奠定理论和实践基础。

实验8-1　多黏菌素E的发酵

（一）实验目的

学习细菌的微生物学特性及培养方法，熟悉和掌握细菌种子扩培方法和机械搅拌通风发酵罐的使用，熟悉和掌握多黏菌素E发酵工艺过程及活性测定方法，熟悉和掌握多黏菌素E发酵过程中代谢参数的测定方法。

（二）实验原理

多黏菌素是（Polymy xin）最早是1946年由日本小山康夫发现的一株多黏类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa Var koyama）产生的一组多肽类抗生素。1947年，美国实验室将其从发酵液中分离并鉴定。随着对多黏菌素研究的深入，根据其结构上的差异，将其分为A、B、C、D、E、K、M、P等组分。在多黏菌素的各个组分中，由于A、C、D、M等组分存在较大的毒性，而多黏菌素B和E的毒性最小，疗效最高，因此真正商品化生产的是多黏菌素B和多黏菌素E。多黏菌素B为人用药，多黏菌素E为禽畜用药。含有多黏菌素E的产品的商品名为硫粘菌素（Colistin），也有的称之为黏杆菌素、抗敌素。多黏菌素E的毒性小、残留低。大鼠和小鼠的口服LD50，均大于12g/kg，而且口服后有60%～80%从粪便中排出，故脏器中分布极少，属于低残留药物。同时，多黏菌素E在土壤中极易分解，不易造成环境污染。

多黏菌素E的结构是环状多肽，由10个氨基酸和1个具有9个碳原子的脂肪酸连接而成，各种多黏菌素E的结构差别不大，仅氨基酸的组成和排列略有不同而已，它们的碱性有所区别。多黏菌素E1和E2的结构见图1-8-1，两组分的基团差异主要在R基团及第3、6、7位上的氨基酸组成上：

图1-8-1　多黏菌素E1和E2的化学结构

多黏菌素E1∶R-MOA（b-甲基辛酸）；X-Dab（二氨基丁酸）；Y-D-leu；Z-leu。
多黏菌素E2∶R-IOA（异辛酸）；X-Dab（二氨基丁酸）；Y-D-leu；Z-leu。

多黏菌素E对革兰氏阴性杆菌有很强的杀菌作用，无论生长期还是静止期的细胞均能很快被杀死。它可以治疗由志贺氏痢疾杆菌（Shigella dysenteriae）、大肠杆菌（Escherichia coli）、绿脓杆菌（Pseudomonas aaeruginosa）、沙门氏菌（Salmonella）和普通变形杆菌（Proteus vulgaris）引起的感染。并对霍乱弧菌（Vibro cholerae）、鼠疫杆菌（Yersinia pestis）等也有良好的作用，但对革兰氏阴性球菌和革兰氏阳性球菌无作用。它与杆菌肽一同使用时，较少剂量就可以获得相同的杀菌效果，即具有良好的协同作用。由于多黏菌素E具有良好的抗菌效果和低毒、残留少的特性，可用于饲料添加剂，促使禽畜生长和提高饲料利用率，并且可以防止饲料大规模生产中常出现的由大肠埃希氏菌和沙门氏菌污染引起的疾病。临床上常用其硫酸盐或磺酸盐，多黏菌素E硫酸盐用得较多，而其磺酸盐多用于非肠道给药途径，在组织中水解出多黏菌素E起作用。

多黏菌素E的生产菌株——多黏芽孢杆菌，属于类芽孢杆菌属。菌体大小为（0.6～0.8）μm×（2.0～5.0）μm，革兰氏阳性、阴性或可变，兼性厌氧，杆状，产芽孢。芽孢端生，产荚膜，周生或侧生鞭毛。多黏芽孢杆菌的菌落为白色，圆形，表面湿润光滑。

多黏菌素E是多黏芽孢杆菌的次级代谢产物，它的生物合成和多黏芽孢杆菌的生长受到许多发酵条件的影响：温度、发酵pH值、溶氧、黏度等。同时还受到一些代谢调控机制的控制：磷酸盐的调节作用、分解代谢产物调节和产生菌生长速率的调节等。

（三）实验材料

1.菌种

（1）多黏类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa 1.548），购自中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCCC）。

（2）大肠埃希氏杆菌［Escherichia colicmCC（B）44103］。

2.主要设备

三角瓶、恒温培养箱、摇床、灭菌设备、超净工作台、恒温水浴锅、电子分析天平、电炉、移液枪、试管、温度计、不锈钢锅、干燥箱、冷冻离心机、pH计、磁力搅拌器、滴定管、显微镜、10L发酵罐、多功能微生物自动测量分析仪。

3.主要试剂

NaCl、葡萄糖、碳酸钙、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氢氧化钠，AR级；

牛肉膏、琼脂、蛋白胨，BR级；

玉米浆干粉、黄豆粉、泡敌，市售。

4.培养基及其制备

（1）斜面试管培养基

①LBG培养基。蛋白胨1.0%，牛肉膏0.3%，葡萄糖0.5%，NaCl 0.5%，pH 7.0，在0.1MPa压力下灭菌20min。

②LB培养基。蛋白胨1.0%，牛肉膏0.5%，NaCl 0.5%，pH 7.0，在0.1MPa压力下灭菌20min。

（2）种子培养基

葡萄糖3.0%，蛋白胨1.5%，NaCl 0.3%，CaCO30.4%，pH 7.0，在0.1MPa压力下灭菌20min。

（3）发酵培养基

葡萄糖5.0%，玉米浆干粉2.0%，氯化钠0.5%，碳酸钙1.0%，（NH4）2SO42.0%，黄豆粉2.0%，泡敌0.3%，pH 6.8，在0.1MPa压力下灭菌20min。

（四）实验方法

1.发酵液pH的测定方法

发酵液经离心后取上清液，pH计直接读取发酵液的pH值。

2.发酵液中还原糖含量测定

发酵液中还原糖含量方法见附录2-4。

3.总糖测定方法

总糖测定方法见附录2-8。

4.发酵液中氨态氮含量的测定方法

（1）测定原理

采用甲醛滴定法测定。利用氨基酸的两性作用，加入甲醛以固定氨基的碱性，使羧基显示出酸性，用氢氧化钠标准溶液滴定后定量，以酸度计测定终点。

（2）测定步骤

吸取5mL样品，置于100mL容量瓶中，加水至100mL刻度，混匀后吸取20.0mL，置于200mL烧杯中，加60mL水，开动磁力搅拌器，用氢氧化钠标准溶液［c（NaOH）＝0.05mol/L］滴定至酸度计指示pH＝8.2，记下消耗体积V1，加入10mL甲醛溶液，混匀。再用氢氧化钠标准滴定溶液滴定至pH＝9.2，记下消耗体积为V2，同时做试剂空白试验，记消耗体积为V0。

（3）计算公式

式中：X—样品中氨基酸态氮的含量，g/L；

　V1—测定用样品稀释液加入甲醛前消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积，mL；

　V2—测定用样品稀释液加入甲醛后消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积，mL；

　V0—试剂空白试验加入甲醛后消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积，mL；

　V3—样品稀释液取用量，mL；

　c1—氢氧化钠标准滴定溶液的浓度，mol/L；

　0.014—与1mLNaOH标准滴定液［c（NaOH）＝1mol/L］相当的氮的质量，g；

　c（NaOH）＝0.05mol/L，使用前需要标定。

5.发酵液菌重变化估测方法（湿菌比，%）

取一定体积的发酵液经8000r/min离心5min后，量取上清液体积。

6.菌丝体干重的测定方法

取发酵液经8000r/min离心5min后，倾去上清液。底部菌体用去离子水在布氏漏斗中洗涤1次。洗涤后装入称量瓶中，在80℃烘箱中烘干至恒重，分析天平称重。计算菌丝干重（g/100mL）。

7.发酵液中磷的测定方法

微量磷的测定一般皆用钼蓝比色。将磷酸或磷酸盐在酸性溶液中，加入钼酸铵使生成黄色磷钼酸，再加入还原剂，使磷钼酸还原成钼酸。与标准磷溶液的显色作比较，测定含量。

发酵液中主要含磷原材料，除磷酸二氢钾为无机磷外，其他如花生饼粉、蛋白胨等，均由动植物有机体组成，以有机化合物的状态存在。在测定无机磷时，为避免有机磷的干扰，先以正丁醇萃取，再以对二苯酚作还原剂，使显蓝色。

将发酵液经过湿法氧化处理，发酵液中的有机磷被氧化成为磷酸，同样以钼酸铵和对二苯酚使显蓝色，直接测定。由全磷中减去无机磷，即为有机磷。

（1）所需试剂

钼酸铵溶液5%，H2O2溶液30%，H2SO4溶液6mol/L，正丁醇0.2mol/L，对苯二酚，2%水溶液，使用前配制。

混合还原液：95mL亚硫酸氢钠溶液（15%）和5mL亚硫酸溶液（5%）相混合。

标准磷基准溶液：准确称取分析纯磷酸二氢钾1.0967g，加水溶解，加入氯仿数滴，用水稀释至250mL，置冰箱中，在0℃下可保存较长时间。

标准磷工作溶液：将上述标准磷基准溶液用水稀释100倍，当日配制。

（2）测定方法

①无机磷。量取发酵液10mL于刻度离心管中，滴加硫酸溶液（6mol/L）至呈酸性，加水至准确20mL，混匀后，离心分离。待上层清澈，量取10mL（相当于原发酵液5mL）加水稀释成50mL，作为试液。［如无离心机，可将发酵液以硫酸溶液（6mol/L）酸化后，用快速滤纸过滤，取滤液稀释后作试液。］

由试液中量取10～20mL（相当于原发酵液1～2mL）置小型分液漏斗中，加入5mLH2SO4溶液（0.2mol/L）及2mL钼酸铵溶液，充分混合数秒钟，在室温下放置1min后，加入8mL正丁醇，摇约1min，待分层清晰后，将水层放出弃去。再加15mL水和1mL对苯二酚溶液，混合后放置5～6min，继续加入1mL混合还原液，摇匀至正丁醇无色，再放置5～6min，将蓝色水溶液移入量筒，加水稀释成25mL，在720nm处测定吸收度。同时作空白试验。

②有机磷。量取发酵液5～10mL于小型凯氏瓶中，加入15～30mLH2SO4溶液（6mol/L），置石棉铁丝网上小心用小火加热蒸发，不使剧烈沸腾。待泡沫消失后，改用直接火加热，至溶液呈褐色时，放冷，加入30%过氧化氢1～2滴，继续加热，若溶液仍为黄色，再滴加过氧化氢。如此反复处理至发生浓白烟，冷却后溶液清晰无色为止。加水溶解，移入量瓶并稀释至100mL，作为试液（如溶液浑浊，可用干燥滤纸过滤）。

量取5～10mL试液于量筒中，加水至约15mL，再加2mL钼酸铵溶液及1mL对苯二酚溶液，混合后，在室温下放置约20min，再加1mL混合还原液，加水稀释至25mL，同样在720nm处测定吸收度。同时作空白试验。由此法测得的为全磷量，减去无机磷，即为有机磷量。

注：发酵液经湿法氧化后，已有相当的酸度，不必再加硫酸，若系标准磷溶液，须加入5mL硫酸铵溶液（0.2mol/L）。

（3）标准曲线绘制

取标准磷工作溶液，分别量取使含磷量为10，20，…，120μg，按照上述操作，用正丁醇萃取和直接用钼蓝比色，于720nm处测定吸收度，绘制两种标准曲线。

8.多黏菌素E效价的测定方法

微生物检定法（管碟法）测多黏菌素E效价单位。

（1）样品处理

取样，将发酵液在4℃，8000r/min条件下离心5min后，取上清液。将上清液用磷酸缓冲液适当稀释后，用管碟法测得其发酵单位。

（2）管碟的制作

将大肠杆菌［CMCC（B）44103］接种于LB液体培养基中，37℃，200r/min培养24h后备用。取灭菌并冷却到50～60℃的LB固体培养基，加入培养皿中，凝固后形成下层培养基。再取1mL大肠杆菌［CMCC（B）44103］菌悬液加到9mL灭菌并冷却到50～60℃的LB固体培养基中，混匀后倒入培养皿中下层培养基上，凝固。在超净工作台中，向双层平板中以等距离均匀放置牛津杯（不锈钢，内径6.0±0.1mm，外径8.0±0.1mm，高1.0±0.1mm）五个。向每个杯中准确加入250μL（此时液面与牛津杯高度持平，符合测量要求）左右、用磷酸盐缓冲液配制的不同浓度的多黏菌素E的标准溶液。在4℃冰箱中放置4h扩散，37℃恒温培养箱中培养18h。

（3）标准曲线的制作

使用ZY-300IV多功能微生物自动检测分析仪或游标卡尺测得抑菌圈的直径，工作站自动生成以效价单位的对数为横坐标，以抑菌圈直径的平方为纵坐标的标准曲线。（或用游标卡尺测量，以效价单位的对数为横坐标，以抑菌圈直径的平方为纵坐标的标准曲线。）

根据《中华人民共和国药典》规定，利用管碟法测定粘杆菌素效价，利用E.coli ［CMCC（B）44103］为指示菌时，其浓度应该控制在614～2344U/mL。

（五）实验步骤

1.实验流程

图1-8-2　多黏菌素E硫酸盐生产流程

2.实验步骤

（1）菌种试管活化

将菌种接于液体LBG试管培养基中，37℃，200r/min培养24h。

（2）种子扩培

摇瓶种子培养基的配制：按种子培养基成分配比，配制培养基，包装灭菌。

接种：在超净工作台上，将试管菌种扩培后的菌种，以10%的接种量接到种子培养基中。

培养：将接种好的种子摇瓶放于30℃恒温摇床上，在转速200r/min，37℃条件下发酵36h。当种子培养液呈稠厚状，菌体形态粗壮，即可接入发酵液。

（3）上罐发酵（以装液系数70%）

发酵培养基的配制：以发酵培养基配方为基础，将除CaCO3和泡敌之外的物料加入罐中，用NaOH调节pH至6.8，加入CaCO3和泡敌，121℃灭菌20min。

火焰保护接种：将培养36h的摇瓶种子按10%的接种量接种于发酵罐中。

培养：将接种后的发酵罐于30℃恒温培养60h，转速为250r/min。

发酵样的测定：接种完毕后，取样进行初始测定。之后每隔6h，取样测定发酵液中代谢参数及上清液效价。

发酵过程可能出现泡沫，需准备灭过菌的泡敌，适时补加泡敌防止逃液。

发酵过程可分为三个不同的代谢期：

①菌体繁殖期。菌体粗壮，繁殖旺盛，菌量迅速增加，培养液外观转变成黏度很大的糊状物。

②分泌期。菌体繁殖趋于减弱，培养基中碳源被利用的速度显著下降，pH下降，多黏菌素E产量迅速上升。

③芽孢形成期。菌体渐老，芽孢数量逐渐增加，培养液外观转稀，多黏菌素E的积累量下降，此时应收获发酵液。

（六）实验结果与分析

表1-8-1　多黏菌素E发酵实验结果记录

（七）实验注意事项

1.在投料前，气路、料路、发酵罐必须用蒸汽进行灭菌，消除所有死角的杂菌，保证系统处于无菌状态。

2.培养基在进罐之前，应先糊化。一般培养基的配制量以罐体全容积的70%左右计算（泡沫多的培养基为65%左右，泡沫少的培养基可达75%～80%），考虑到在位灭菌过程会出现冷凝水，首次向培养基中补水至配制体积的50%左右，不足部分灭菌结束后补入。

3.灭菌初期应只打开夹套蒸汽阀对罐内培养基预热，以避免产生过多冷凝水。当罐内温度升到90℃时，打开罐上其他进气阀，通入蒸汽，使罐内温度迅速上升到121℃左右。

4.当罐压升至0.1MPa，温度升到121～123℃时，控制蒸汽阀门开度，保持罐压不变，20min后停止供汽。

5.发酵过程中取样时应对取样管路进行蒸汽消毒，取样时先将发酵液排出一部分，防止发酵液与前次的混合，影响测量结果。

6.发酵过程中对发酵液的各项指标进行准确的测定，密切关注发酵条件的变化，注意环境卫生及无菌操作，防止发酵过程染菌。

实验8-2　链霉素的发酵

（一）实验目的

学习放线菌的微生物学特性及培养方法，熟悉和掌握种子扩培方法和机械搅拌通风发酵罐的使用，熟悉和掌握链霉素发酵工艺过程及抗菌活性测定方法，熟悉和掌握链霉素发酵过程中代谢参数的测定方法，熟悉和掌握链霉素的测定方法。

（二）实验原理

氨基糖苷类抗生素是由氨基环醇和氨基糖类以糖苷键形式结合而成的一族碱性水溶性广谱抗生素，主要有链霉素、卡那霉素、庆大霉素、新霉素、巴龙霉素等。近年来还出现了一些新品种，如丁胺菌霉素、妥布霉素、核糖霉素、青紫霉素等。

链霉素（Streptomycin）是一种氨基葡萄糖型抗生素，分子式C21H39N7O12，分子量581.59。它由灰色链霉菌（Streptomyces griseus）产生，能有效地抑制许多细菌，如结核杆菌、鼠疫杆菌、大肠杆菌等。目前主要用其盐治疗结核病、鼠疫、百日咳、细菌性痢疾、泌尿道感染和主要由革兰氏阴性细菌引起的其他传染病。

链霉素是由链霉胍、链霉糖和N-甲基-L-葡萄糖胺通过糖苷键装配而成的化合物。链霉素的化学结构式如图1-8-3。

图1-8-3　链霉素化学结构式

链霉素游离碱为白色粉末，大多数盐类也是白色粉末或结晶，无臭，味微苦。链霉素分子中有3个碱基基团，其中2个是链霉胍上的强碱性胍基，第三个是葡萄糖胺上的弱碱性甲氨基。因此，链霉素在水溶液中随着pH降低可能依次以4种不同的形式存在：链霉素游离碱、一价阳离子、二价阳离子和三价阳离子。链霉素分子中含有较多亲水性基团，易溶于水，难溶于有机溶剂。链霉素盐酸盐易溶于甲醇，难溶于乙醇，而硫酸盐即使在甲醇中也很难溶解。链霉素比较稳定，空气和阳光对干燥粉末的影响不大。但链霉素的游离碱或盐均易吸收空气中的水分而潮解，潮解后含水量增加，易分解，稳定性下降。链霉素的水溶液比较稳定，但稳定性受pH和温度的影响较大。

链霉素的生产菌株——灰色链霉菌具有发育良好的菌丝体，菌丝体分支，无隔膜，直径0.4～1.0μm，长短不一，多核。菌丝体有营养菌丝、气生菌丝和孢子丝之分。孢子丝中的分生孢子灰白色，柱形。灰色链霉菌的菌落灰白色，后期生褶皱，成辐射状。

链霉素是典型的次级代谢产物，其发酵过程分为菌体的生长期、产物合成期和菌体自溶期三个阶段。灰色链霉菌的生长和链霉素的生物合成受到许多发酵条件的影响：温度、发酵pH值、溶氧、接种量、泡沫等。同时还受到一些代谢调控机制的控制：磷酸盐的调节作用、分解代谢产物调节和产生菌生长速率的调节等。

（三）实验材料

1.菌种

灰色链霉菌（Streptomyces griseus，CICC 11002），从中国工业微生物菌种保藏管理中心（CCICC）购得。

2.主要设备

三角瓶、恒温培养箱、摇床、灭菌设备、超净工作台、恒温水浴锅、电子分析天平、电炉、移液枪、试管、温度计、不锈钢锅、干燥箱、冷冻离心机、pH计、磁力搅拌器、滴定管、显微镜、10L发酵罐、HPLC色谱仪。

3.主要试剂

硫酸镁、葡萄糖、碳酸钙、氢氧化钠、碘化钾、盐酸、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾，AR级；

酵母膏、琼脂，BR级；

黄豆饼粉、玉米浆干粉、α-淀粉酶，市售。

4.培养基及其制备

（1）斜面试管培养基

酵母膏2.0%，葡萄糖2.0%，K2HPO40.05%，mgSO40.05%，琼脂2.0%，pH 7.8，在0.1MPa压力下灭菌20min。

（2）种子培养基

酵母膏6.0%，葡萄糖4.0%，K2HPO41.0%，mgSO41.0%，pH 7.8，在0.1MPa压力下灭菌20min。

（3）发酵培养基

葡萄糖4.0%，黄豆饼粉0.8%，玉米浆1.5%，（NH4）2SO40.5%，泡敌0.05%，pH 7.2～7.4，在0.1MPa压力下灭菌20min。

（四）实验方法

1.发酵液pH的测定方法

发酵液经离心后取上清液，pH计直接读取发酵液的pH值。

2.发酵液中还原糖含量测定

发酵液中还原糖含量方法见附录2-4。

3.总糖测定方法

总糖测定方法见附录2-8。

4.发酵液中氨态氮含量的测定方法

参见实验8-1“多黏菌素E的发酵”部分发酵液中氨态氮含量的测定方法。

5.发酵液菌重变化估测方法（湿菌比%）

取一定体积的发酵液经8000r/min离心5min后，量取上清液体积。

湿菌比%＝（总体积—上清液体积）×100/总体积

6.菌丝体干重的测定方法

取发酵液经8000r/min离心5min后，倾去上清液。底部菌体用去离子水在布氏漏斗中洗涤1次，洗涤后装入称量瓶中，在80℃烘箱中烘干至恒重，分析天平称重。计算菌丝干重（g/100mL）。

7.发酵液中磷的测定方法

参见实验8-1“多黏菌素E的发酵”部分发酵液中磷的测定方法。

8.发酵液中链霉素效价的测定方法

（1）样品处理

取样，用草酸将发酵液酸化至pH 3左右，加热至（70～75℃），维持2min，使蛋白凝固。之后迅速冷却、过滤或离心分离。过滤后，所得的酸性滤液进行碱液处理，用NaOH调pH至7.0，备用。

（2）紫外分光光度法

①链霉素标准曲线的制作。链霉素标准贮备液（5mg/mL）：准确称取链霉素标准品500mg，加入少量的酸性甲醇溶液溶解，定容至100mL棕色容量瓶中，摇匀储存在冰箱中。准确移取链霉素标准贮备液1、2、3、4、5、6mL，分别置于100mL棕色容量瓶中，用水溶液稀释至刻度，摇匀。系列中链霉素浓度分别为0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3mg/mL，在波长525nm处读取吸光度，以水为空白。以标准溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，建立标准曲线。

②样品测定。取样品处理液5mL，加0.2mol/L氢氧化钠5mL，置水浴加热10min。再置冰浴中冷却5min，加入3mL的1.5%铁试剂（1.5%铁试剂的配制：称取15g硫酸高铁铵，用0.25mol/L硫酸溶液溶解，并稀释至1000mL，摇匀即得）摇匀，再加水定容至25mL，放置20min后测定，检测波长λ525nm。根据稀释倍数，将所测吸光度值查标准曲线，即得样品效价。

（3）高效液相色谱法

①色谱柱：C18柱；流动相：甲醇∶乙腈：0.1mol/L草酸（1∶1∶6）：检测器：UV检测器；检测波长：365nm；流速：1.0mL/min；进样量：10μL。

②链霉素标准贮备液（8.0μg/mL）。准确称取8.0mg链霉素标样，加入少量的酸性甲醇溶液溶解，定容至1000mL棕色容量瓶中，摇匀，储存在冰箱中。

③链霉素标准曲线的制作。准确移取链霉素标准贮备液2.5、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0mL，分别置于100mL棕色容量瓶中，用酸性甲醇溶液稀释至刻度，摇匀。系列中链霉素的浓度分别为0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0pg/mL的稀释液，经0.45μm滤膜过滤，进行HPLC分析，以标准溶液浓度为横坐标、相应峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

④将样品处理液经0.45μm滤膜过滤，进行HPLC分析，根据峰面积，查标准曲线，获得效价。

（五）实验方法与步骤

1.实验流程

图1-8-4　链霉素生产流程

2.实验步骤

（1）菌种活化

无菌条件下，从甘油冻存管中取适量灰色链霉菌孢子涂布在孢子活化固体培养基上，然后置28℃，恒温培养7～10d。

（2）种子制备

摇瓶种子培养基的配制：按种子培养基成分配比，配制培养基，包装灭菌。

接种：在超净工作台上，刮取适量孢子于灭过菌的摇瓶种子培养基中。

培养：将接种好的种子摇瓶于28℃恒温摇床上，转速为230r/min，培养48h左右。

（3）上罐发酵（以10L罐为例，装液系数70%）

①发酵培养基的配制。

以发酵培养基配方为基础，将除CaCO3和泡敌之外的物料加入罐中，用NaOH调节pH至7.0～7.2。121℃灭菌20min。

②火焰保护接种。

在发酵罐接种口，将摇瓶种子以10%的接种量接种于发酵罐中。

③培养。

将接种后的发酵罐于28℃恒温培养10d，转速为200r/min。

④发酵样的测定。

每天需取样测定pH、总糖、菌浓等指标。

发酵72h后开始每天取样测发酵液中链霉素的含量。

发酵过程可能出现泡沫，需准备灭过菌的泡敌，适时补加泡敌防止逃液。

⑤第10d放罐。

发酵结束，用草酸将发酵液酸化至pH 3左右。然后通入蒸汽加热至70～75℃，维持2min，迅速冷却、过滤或离心分离。过滤后，用NaOH调滤液pH值至6.7～7.2，以备后续分离纯化使用。

⑥发酵罐空消。

发酵罐彻底清洗后，打开排水阀，排尽夹套中的水。同时排尽蒸汽管中冷凝水后，先对空气过滤器进行灭菌，让蒸汽徐徐进入发酵罐；对发酵罐进行空消。在灭菌过程中，应时刻注意罐压，并控制在（0.11～0.12）MPa，请勿超压。罐压的控制通过调节进气阀和排气阀来实现。空消时间一般为30～50min。到规定时间后，关闭进气阀和排气阀。当罐温降至80℃以下时排尽发酵罐内的冷凝水。为防止发酵罐内产生负压，必须通入无菌空气，使罐压保持在（0.03～0.05）MPa。

（六）实验结果与分析

表1-8-2　链霉素发酵实验结果记录

续　表

（七）实验注意事项

1.在投料前，气路、料路、发酵罐必须用蒸汽进行灭菌，消除所有死角的杂菌，保证系统处于无菌状态。

2.培养基在进罐之前，应先糊化。一般培养基的配制量以罐体全容积的70%左右计算（泡沫多的培养基为65%左右，泡沫少的培养基可达75%～80%），考虑到在位灭菌过程会出现冷凝水，首次向培养基中补水至配制体积的50%左右，不足部分灭菌结束后补入。

3.灭菌初期应只打开夹套蒸汽阀对罐内培养基预热，以避免产生过多冷凝水。当罐内温度升到90℃时，打开罐上其他进汽阀，通入蒸汽，使罐内温度迅速上升到121℃左右。

4.当罐压升至0.1MPa，温度升到121～123℃时，控制蒸汽阀门开度，保持罐压不变，20min后停止供汽。

5.发酵过程中取样时应对取样管路进行蒸汽消毒，取样时先将发酵液排出一部分，防止发酵液与前次的混合，影响测量结果。

6.发酵过程中对各项发酵液的各项指标进行准确的测定，密切关注发酵条件的变化，注意环境卫生及无菌操作，防止发酵过程染菌。

7.链霉菌是好氧性微生物，因此液态深层培养时必须供给足够的氧气。通风量一般为理论计算需氧量的2.8～3.0倍，发酵前、中、后期可根据发酵实际情况进行调节，但绝不能中断供氧，以免导致菌体死亡。

8.链霉素发酵过程中产生泡沫是正常现象，或泡沫过多，造成溢罐。可使用少量植物油或消泡剂进行消泡。

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（编者：陈　敏）