常用培养基

培养基是维持细胞体外生存和生长的基本溶液，是组织细胞培养的最重要的条件。除了必须提供适当的温度、空气、水、无菌条件外，最重要的是使细胞赖以生存的培养基接近于体内的生理环境，保证细胞能够正常的生存、生长，并维持其结构及功能。按性质可分为固体培养基和液体培养基，按来源可分为天然培养基和合成培养基两大类。

一、天然培养基

天然培养基主要是指来自动物体液或利用组织分离提取的一类培养基。其种类很多，包括生物性液体（如血清）、组织提取液（如胚胎浸液）、凝固剂（如血浆）等。细胞培养方法建立的初期，体外培养均是用天然培养基，其中血清是一种仍在广泛应用的天然培养基，市场上亦有产品出售。天然培养基的优点是营养成分丰富，含有各种细胞生长因子、激素类物质，渗透压、pH等也与体内环境相似，培养效果好；缺点是制作过程复杂，成分复杂，不同批次间差异大，来源受限。因此，逐渐被合成培养基所代替。

（一）血清

组织细胞培养中最常用的天然培养基是血清，因为血清中含有很多种丰富的营养物质，对促进细胞繁殖、黏附及中和某些化学物质的毒性起着一定的作用，包括大分子的蛋白质和核酸等。组织细胞培养所用的血清很多，其来源主要是动物，牛血清是用量最大的天然培养基，含有丰富的细胞生长所必需的营养成分。目前市场上有多种产品出售，但产品质量差别很大，要注意选择。一般外购的血清只做过灭菌，在用前常需进行灭活处理（加温到56℃，30min）以消除补体活性，未灭活的血清应－20℃冰箱保存。

1．种类　血清分为人血清和动物血清两大类。培养人细胞用人血清，物种相同，对细胞有利，但价格昂贵，使用时要监测HIV、乙肝病毒等，故较少应用。动物血清常用，其来源可来自牛、马、猪、兔等动物，以牛和马血清为好。两者中牛血清比马血清用得更多；牛血清分胎牛血清、新生牛血清和小牛血清三种。胎牛血清是从母牛剖腹取出的胎牛中分离出的血清，血清中所含对细胞生长有害的成分最少，品质最高，价格昂贵。新生牛血清取自出生24h之内的新生牛。小牛血清是从刚出生，但尚未哺乳的小牛分离出的血清。小牛血清和胎牛血清较为常用。因为未与外界接触，胎牛血清中所含的抗体、补体等成分最少，所以胎牛血清品质是最高的。尤其胎牛血清富含有丝分裂因子，常选其作增殖细胞用的血清，对培养要求较高的细胞系和克隆化培养效果好。

2．血清中成分 血清是由血浆去除纤维蛋白而形成，血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、糖类、生长因子、激素、无机物等，这些物质可以确保促进细胞生长与抑制细胞生长的因素达到生理平衡（表27－3）。

（1）蛋白质：蛋白质是血清中的主要成分，一般蛋白质含量为40～80mg／ml，但在培养中除那些能携带金属离子、脂肪酸和自身是激素的蛋白质外，其他还有哪些蛋白为培养细胞不可缺少的，尚不清楚。有作用的蛋白质主要为白蛋白和球蛋白。纤维粘连素能促细胞附着，α2－巨球蛋白有抑制胰蛋白酶的作用。胎牛血清中含有胎球蛋白也能促进细胞附着。转铁蛋白能结合铁离子，减少其毒性和被细胞所利用。

（2）多肽：凝成血块后析出的血清有促细胞增殖作用，要比去掉血细胞后分离出的血清作用强。现已清楚，是因在凝血过程中从血小板释放出来的一种多肽血小板促生长因子（PDGF）对细胞有促增殖作用。血清中还含有其他生长因子，如FGF、EGF、MSA等，但其含量较少。

（3）激素：激素对细胞的作用是多方面的。胰岛素有促细胞摄取葡萄糖和氨基酸的作用；它的这些作用可能与其能促进细胞分裂有关。有一些生长因子（如IGF1、IGF2等），能与细胞表面的胰岛素受体相结合，从而具有与胰岛素同样的作用。在胎牛血清中也含有不定量的氢化可的松，它可能兼有促细胞贴附和增殖作用；但有人证明，在一定条件下，如细胞密度高时，对细胞可能有抑制作用和诱导其发生分化的作用。

表27－3　血清成分

（4）其他成分：血清亦含有氨基酸、葡萄糖、酮酸、核苷等一些营养成分和中间代谢产物。血清置换实验证明，血清中也含有一些与蛋白相结合状态的微量元素，对培养细胞是有意义的。此外，血清中含有抑制细胞增殖成分，其中有的可能为血清制备过程中混入的。γ－球蛋白组分可能含有与培养细胞有交叉反应的抗体，用热灭活方法可除掉，且不伤害多肽生长因子，不过有时也难免去除掉一些其他有用的成分。因此，热灭活血清并不一定比不灭活血清令人满意。

3．血清的制备和评价 和其他天然培养基一样，血清也能在实验室自己制备，尤其制备小动物血清，因用量较少，是很容易进行的。采血可从动物体表大的静脉或动脉用注射器直接抽血采集。若从动脉采集，一般需用乙醚等麻醉动物，解剖出动脉或心脏再抽血。然后，立即注入无菌管中，室温静置，待凝血坚实血清析出后，吸出上清，以每分钟3 000～4 000转离心；然后再分离一次上清，即可应用。制备中一切操作如不能做到完全无菌，则最终血清还须通过0．22μm微孔滤膜滤过处理。血清是比较黏稠的液体，滤过缓慢，比较麻烦。因此，操作中要保证做到无菌才好。

一般细胞培养多用牛血清，用量较大，现牛血清已商品化。从国外或国内均可定购到各厂家的小牛血清制品，因此已无自制必要。血清可制成单牛血清和混合血清。单牛血清来源于一个小牛，混合血清为多个牛血清的混合物，一般血清均为混合血清，有成分互补的优点，更适于细胞生长。

使用血清有下列优点。

（1）提供基本营养物质：血清中含有各种氨基酸、维生素、无机物、脂类物质、核酸衍生物等，都是细胞生长所需的基本营养物质。

（2）提供贴壁和扩展因子：许多体外培养的细胞必须贴附于培养器皿才能生长，帮助细胞贴壁的物质都属于细胞外基质，细胞在体内生长时具有分泌细胞外基质的功能，而在体外生长时，随着传代次数的增加这种能力逐渐下降甚至丢失。血清中含有这类物质，如纤连蛋白（FN）、层粘连蛋白（LN）等，它们可以促进细胞贴壁。

（3）提供激素及各种生长因子：血清中含各种激素，如胰岛素、肾上腺皮质激素（氢化可的松、地塞米松）、类固醇激素（雌二醇、睾酮、孕酮）等。同时含有各种生长因子，如FGF、EGF、PDGF等。

（4）提供结合蛋白：结合蛋白的作用是携带重要的低分子量物质，如白蛋白携带维生素、脂肪（脂肪酸、胆固醇）及激素等，转铁蛋白携带铁。结合蛋白也在细胞代谢过程中起重要作用。

（5）对培养中的细胞提供某些保护作用：有一些细胞，如内皮细胞、骨髓样细胞可以释放蛋白酶，血清中含有抗蛋白酶的成分，起到中和作用。这种作用是偶然发现的，但已经是有目的地使用血清来终止胰蛋白酶的消化作用，现在胰酶已广泛应用于贴壁细胞的消化传代。血清蛋白形成了血清的黏度，可保护细胞免受机械损伤。特别是在悬浮培养搅拌时，黏度起到重要作用。血清中还含有一些微量元素和离子、它们在代谢解毒中起重要作用，如SeO3、硒等。

但血清的成分复杂，虽然含有许多对细胞有利的成分，但也不可避免地含有对细胞有害的成分，使用血清有几个明显的缺点。

（1）对大多数细胞，在体内状态时，血清不是它们接触的生理学液体，只是在损伤愈合及血液凝出过程中才接触血清，因此使用血清有可能改变某种细胞在体内的正常状态，血清可能促进某些细胞的生长（如成纤维细胞）同时抑制另一类细胞的生长（如表皮角质细胞）。

（2）血清中的成分繁多，目前对其精确的成分、含量和作用机制仍不清楚，这给研究工作带来许多困难；血清中含有一些物质对细胞会产生毒性作用，如多胺氧化酶，它能与来自高度繁殖细胞的多胺起反应（如精胺、亚精胺）形成有细胞毒作用的聚精胺。此外，补体、抗体、细菌毒素等都会影响细胞的生长，甚至造成细胞死亡。

（3）每批血清之间都有差别，其成分不能保持一致，从而使实验的标准化和连续性受到限制。

（4）取材过程有可能带入支原体和病毒，对培养的细胞产生潜在影响，可能导致实验失败或实验结果的不可靠。

4．血清的使用与储存

（1）使用前处理：除了对于一些品质高的胎牛血清和新牛血清可以考虑不经灭活直接使用。大部分血清在使用前必须灭活处理，即56℃30min。灭活的目的是去除血清中的补体成分，避免补体对细胞产生毒性作用。血清经过灭活也会损失一些对细胞有利的成分，如生长因子，因此也有人提出血清不经灭活直接用于培养，这样做的前提是确认血清中不含补体成分。

（2）储存：血清一般储存于－20℃，同时应避免反复冻融。购买大包装的血清后，首先要灭活处理，然后分装成小包装，储存于－20℃，使用前融化。融化时最好先置于4℃。融化后的血清在4℃不宜长时间存放，应尽快使用。

（3）使用浓度：大多数时候，血清是作为一种添加成分与合成培养基混合使用，使用浓度一般为5%～20%，最常用的是10%。过多血清容易使培养中的细胞发生变化，特别是一些二倍体的无限细胞系，迅速生长后容易发生恶性转化。

血清虽为当前细胞培养中不可缺少的天然培养基，但其含有很多难以控制的复杂不明成分，加上供血动物的个体差异，有不利分析细胞生物学反应之弊。因此，长久以来，人们一直在研究不用血清的无血清培养基，并已取得很大进展。预期将来天然培养基必将被更加完善的无血清培养基所取代。关于无血清培养基问题后面将单独叙述。

（二）胶原

胶原是细胞生长的良好基质，主要用于细胞的附着，能改善细胞表面性质，促进细胞生长。它是从动物特定的组织中用人工法提取出的，利于组织和细胞的固定，亦属天然培养基。胶原可来自大鼠尾腱、豚鼠真皮、牛真皮等，其中以鼠尾胶原最为常用和制备简便，可配制成0．1%～1%的醋酸溶液。

使用时，用吸管吸少许胶原涂于灭菌培养瓶面上，不宜太厚，以倾斜瓶时不流动为准；向培养瓶内通以氨气后封上瓶盖；或用浸有氨水的棉球堵塞瓶口（或不用氨气处理，而是置37℃温箱过夜；或置室温48h，在用无菌蒸馏水冲洗晾干亦可），作用30min，待胶原凝固，然后用无菌生理盐水冲洗、晾干，即可使用。

（三）水解乳蛋白

水解乳蛋白系乳白蛋白经蛋白酶和肽酶水解的产物，是常用的天然培养基。含有丰富的氨基酸，近年来由于广泛使用合成培养基，已代替了乳白蛋白。但其成分简单，在培养基不足等特殊情况下尚有其应用价值。

水解乳白蛋白为蛋黄色粉末，配法如下：①称量，称0．5g水解乳蛋白粉入烧杯中，加少许灭菌Hanks液调成糊状；②溶解，补加Hanks液至100ml，不断搅拌，令充分溶解，置室温1～2h，并不时搅拌；③过滤，滤纸滤过，分装入瓶中；④灭菌，70kPa，10min高压蒸汽灭菌，4℃冰箱保存。

二、合成培养基

合成培养基是根据研究和了解细胞所需成分在平衡盐溶液的基础上配制而成的。一般都含有氨基酸、维生素、无机离子和一些其他辅助性成分。目的在于模拟出与体内相似的生存环境。合成培养基有固定的组成成分，有利于控制实验条件标准化，合成培养基的应用极大地促进了培养细胞的发展。合成培养基已成为现今普遍使用的培养基。合成培养基不能促进细胞繁殖生长，使用时可能需添加天然培养基，主要是含有促细胞增殖的各种生长因子和其他有利于细胞生存物质的牛血清。

（一）基本组分

细胞代谢包括蛋白质代谢、核酸代谢、糖代谢、脂类代谢等，因此合成培养基的成分必须考虑到细胞代谢的基本规律和需求。经研究，无机盐、氨基酸、维生素和糖类是四大基本组分，低限量基础培养基（medium essential media，MEM），它含有20多种必不可缺的细胞生长所需物质。

1．无机盐 CaCl2、KCl、MgSO4、NaCl、NaHCO3、NaH2PO4。

2．氨基酸 精氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸和缬氨酸（均为L型）。

3．维生素 偏多酸钙、氯化胆碱、叶酸、肌醇、烟酰胺、吡哆醛、核黄素、硫胺素。

4．糖类 葡萄糖、核糖、脱氧核糖、丙酮酸钠、醋酸钠。

合成培养基性质稳定，便于储存、运输、价格便宜，为使用和配制带来极大方便。多数特殊要求也可在现有的合成培养基基础上补加或调整某些成分予以满足。除专门从事研究培养基者外，各实验室已无必要自己配制培养基。购买后按说明可了解其成分、适用的细胞种类和配用方法。

（二）种类

现今国内外都普遍使用市售的干粉或液体合成培养基，如199培养基，Eagle培养基（MEM培养基），Ham培养基等。

1．MEM培养基 前面已述，成分简单，仅含有12种必需氨基酸、谷氨酰胺，8种维生素及必要的无机盐，成分简单，易于添加各种特殊成分以适应不同的细胞培养条件。

2．DMEM（Dulbecco’s modified Eagle medium）培养基 是由Dulbecco等在MEM培养基的基础上研制而成。与MEM相比主要是增加了各成分的用量，同时又分为高糖型和低糖型，高糖型含葡萄糖4．5g／L，低糖型含量为1．0g／L。高糖型有利于细胞停泊于一个位置生长，适合于生长较快、附着较困难的肿瘤细胞。

3．IMDM（Iscove’s modified Dulbecco’s medium）培养基 是Iscove等对DMEM培养基的改良结果。含有42种成分，与DMEM相比增加了许多非必需氨基酸及一些维生素，增加了HEPES，葡萄糖含量与高糖型相同。IMDM适合于细胞密度较低、细胞生长较困难的情况，如细胞融合之后杂交细胞的筛选培养，DNA转染后转化细胞的筛选培养。

4．RPMI 1640培养基 是由Moor等研究成功的，最初是为培养小鼠白血病细胞而设计的。开始的配方特别适合于悬浮细胞生长，主要针对淋巴细胞，后经几次改良，从RPMI1630、RPMI1634，直至RPMI 1640。其组分较为简单，适合于许多种类细胞的生长，如肿瘤细胞或正常细胞、原代培养或传代培养的细胞。RPMI1640是目前应用最为广泛的培养基之一。

5．199培养基、109培养基 199培养基是Morgan等在1950年研制成功的，是最早出现的培养基之一，当时是为培养鸡胚组织而设计的，199培养基成分有60多种，几乎含所有氨基酸、维生素、生长激素、核酸衍生物等。109培养基是199培养基的改良之作，比199培养基效果更好。

6．Ham F10培养基、Ham F12培养基

1962年，Ham针对小鼠二倍体细胞克隆化培养设计了F7培养基，在此基础上进行改良成为F10培养基，使之不仅适合于小鼠二倍体细胞，也适合于人类二倍体细胞的培养。Ham在1963年又研制出了F12培养基，这种培养基的特点是在配方中加入了一些微量元素和无机离子，可以在加入很少血清的情况下应用，特别适合于进行单细胞分离培养。Ham F12培养基也是无血清培养基中常用的基础培养基。

7．McCoy’s 5A培养基 McCoy’s 5A

培养基是McCoy T．A等在1959年研制成功的，是一种专门为肉瘤细胞设计的培养液，后来发现它特别适合于原代细胞培养，适合于较难培养的细胞的生长。

上述培养基都已商品化，并且同一种培养基还有不同形式的产品，如干粉的或液体的，大包装的或小包装的。液体的还分为10倍浓缩液、2倍浓缩液及工作液等。有些培养基不含酚红，有些不含钙、镁离子，使用时可以根据实验需要选择产品。

（三）配制过程和方法

1．准备好分装的瓶子瓶塞、滤器等消毒。

2．制备新鲜去离子水（超纯水或三蒸水）。

3．加温水至15～30℃。

4．在所需水量的2／3中加入干粉，搅拌让其充分溶解。

5．按需要量加入碳酸氢钠。

6．加入至最终量。

7．调pH，用1mol／L HCl或1mol／L NaOH调pH7．2左右。

8．过滤，在超净工作台上用0．22μm滤器过滤分装。

9．贮存于－20℃冰柜中，同时留一小瓶在孵箱中培养，观察有无污染。

三、无血清培养基

无血清培养基，即不需要添加血清就可以维持细胞体外生长繁殖的合成培养基。虽然血清的生物学效应已经被证实，它有很多优点，含有多种生长因子和活性物质，能满足大部分细胞的生长条件。但血清成分复杂，不明因子繁多，影响细胞生长调节机制、各项基因表达等的精密调节，还可能含有一定的细胞毒性物质和抑制物，影响某些细胞功能的表达，血清中的生长因子对于Fb有较强的促有丝分裂作用，并可通过诱导终末分化抑制上皮细胞增殖，不利于上皮细胞的生长。还有许多研究为减少实验过程中的干扰因素，要求使用不含有血清成分的培养基，因此无血清培养技术逐渐成为研究热点和发展方向。Wu等在Ham F12培养基中加入胰岛素、转铁蛋白、EGF进行兔气管上皮细胞培养，成功的培养出气管纤毛细胞。他们还检测不同浓度FBS的对细胞培养的影响，发现当加入0．01%～0．1%的FBS时，对细胞贴壁和生长没有明显影响；当加入FBS＞0．1%时，血清可促进细胞贴壁，但却抑制细胞的生长，同时也抵消了EGF、胰岛素的作用。

无血清培养基分为基础培养液和添加成分两大部分。基础培养液根据培养细胞种类不同而不同，一般以Ham F12培养基和DMEM培养基最为常用，如培养KC可用Epilife和K－SFM（keratinocyte serum free medium）、MCDB153培养基。

添加成分包括以下几大类物质：

（一）促贴壁物质

贴壁细胞需贴附瓶壁才能生长，这种情况下无血清培养基中一定要添加促贴壁因子，一般是细胞外基质，如纤连蛋白（FN）、层粘连蛋白（LN）等。它们还是重要的分裂剂及维持正常细胞功能的分化因子，对许多细胞的繁殖和分化起着重要的作用。纤连蛋白主要促进来自中胚层细胞的贴壁和分化，这些细胞包括Fb、肉瘤细胞、粒细胞、肾上皮细胞、肾上腺皮质细胞、CHO细胞、成肌细胞等。而层粘蛋白主要促进内皮细胞及来自外胚层的细胞，如表皮细胞、支气管上皮细胞、分泌型上皮细胞、神经细胞和肝细胞等的贴壁和生长。

（二）促生长因子及激素

针对不同的细胞添加不同的生长因子，如培养角质细胞加表皮生长因子（EGF）。培养神经细胞加神经生长因子（NGF）。培养内皮细胞加内皮细胞生长因子（ECGF）等。当然，有些生长因子可以刺激多种细胞的生长，表27－4总结了部分生长因子的使用情况。激素也是刺激细胞生长、维持细胞功能的重要物质。有些激素对于许多细胞是必不可少的，如胰岛素。还有一些激素对特定的细胞有重要的作用，如泌乳素对乳腺上皮细胞培养来说是必不可少的。

表27－4　无血清培养基中添加的细胞生长因子

（三）酶抑制剂

培养贴壁生长的细胞，需要用胰酶消化传代。在无血清培养基中必须含有酶抑制剂，以终止胰酶的消化作用，达到保护细胞的目的。最常用的是大豆胰酶抑制剂。

以下是一种无血清培养基的基本配方。DMEM∶F12＝1∶1（v／v）、转铁蛋白5μg／ml、纤粘蛋白lμg／ml、胰岛素5μg／ml、硒30mmol／L、牛血清白蛋白1mg／ml、EGF 25ng／ml、大豆胰酶抑制剂1～5mg／ml。目前也有市售的有针对性成分的培养基，只需在使用时添加一些生长因子和特殊因子即可。如KSFM培养基在使用前加入EGF和牛垂体提取物即可使用。