表皮角质形成细胞

表皮角质形成细胞_组织工程学实验技

皮肤由表皮与真皮两部分组成。表皮是皮肤的浅层，为角化的复层扁平上皮，可分为基底层、棘层、颗粒层、透明层、角质层5层。只有基底细胞具有增殖能力。表皮细胞主要有两类，即角质形成细胞（keratinocytes，亦称角朊细胞，或角蛋白细胞）和非角质形成细胞（non－keratinocytes）。前者占表皮细胞的绝大多数，其特点为基底层细胞借桥粒与基底膜相连，有活跃的细胞分裂；可产生角蛋白（keratin），胞质内含有张力原纤维（tonofibril）。非角质形成细胞数量少，分散存在于角朊细胞之间，包括黑色素细胞（Malanocytes）、朗格汉斯细胞（Langerhans　cell）、梅克尔细胞（Merkel　cell），它们各有自身特定的功能，与表皮角化无直接关系。一般所说的表皮细胞指角质形成细胞，因其占绝大多数。真皮主要由致密结缔组织构成，主要细胞成分是成纤维细胞。

本节主要介绍表皮角质形成细胞的分离与培养。

1950年Billingharn第一次成功地在不损伤表皮细胞活力的同时用胰蛋白酶消化法将表皮从真皮分离下来。1975年，Rheinwald和Green在体外连续培养人类表皮角质形成细胞获得成功，其要点是以小鼠3T3细胞作为角质形成细胞的饲养层，并使用含胎牛血清的培养液。这一里程碑式的成就为人类修复皮肤缺损展示了美好的前景。1981年O’Connor首次应用此方法在体外培养出适于移植的人自体表皮细胞膜片。在用于临床的表皮细胞体外培养过程中，因使用的3T3细胞是异种细胞，常可产生对人体不利的抗原和蛋白质，产生免疫排斥反应。所以，为寻求接近体内环境的培养条件、消除异种蛋白的影响，后来又发展了无饲养层、无血清的角质形成细胞培养法。本节将分别介绍以小鼠3T3细胞作为饲养层的角质形成细胞培养方法和无饲养层、无血清的角质形成细胞培养法。

一、角质形成细胞的饲养层培养法

（一）材料

1．饲养层细胞　为来源于瑞士小鼠胚胎瘤的成纤维细胞系3T3细胞。在表皮细胞培养中常规用照射处理过的3T3细胞作饲养层，3T3细胞一般应维持在低密度条件下培养。

2．皮肤来源　一般采用外科手术切除下的包皮、乳房或腹部皮肤，新生儿、小儿包皮最好。

3．培养液

（1）3T3细胞培养液：DMEM培养基，添加10%胎牛血清、4mmol／L谷氨酰胺以及100U／ml青霉素和100μg／ml链霉素。

（2）皮肤标本储运液：DMEM培养基，添加10%胎牛血清、100U／ml青霉素、100μg／ml链霉素、2．5μg／ml两性霉素和50μg／ml庆大霉素。

（3）角质形成细胞培养液：为DMEM与F12的混合培养基，按3∶1（V／V）比例混合，添加10%胎牛血清、4mmol／L谷氨酰胺、100U／ml青霉素、100μg／ml链霉素、0．4μg／ml氢化可的松、10－10　M霍乱毒素、5μg／ml转铁蛋白、2×10－11　M三碘甲腺原氨酸、1．8×10－4　M腺嘌呤、5μg／ml胰岛素和10ng／ml表皮生长因子。DMEM与F12的基础培养基4℃保存，添加剂以浓缩液的形式－20℃保存，新鲜配用，一般不超过2周。

4．其他培养用液

（1）PBS液：无钙镁磷酸盐缓冲液，成分为1%（W／V）NaCl，0．025%KCl，0．144% Na2HPO4，0．025%KH2PO4，调整溶液的pH为7．2，高温、高压消毒灭菌，室温下储存备用。

（2）胰蛋白酶－EDTA消化液：将0．25%的胰蛋白酶溶液和0．02%的EDTA溶液按1∶4（V／V）的比例配制。

（3）丝裂霉素C：浓度为400μg／ml，溶于培养用双蒸水中，4℃避光保存。

（4）中性蛋白酶（dispase）液：用3T3细胞培养基配制，浓度为2mg／ml，过滤消毒，即配即用。

5．培养器皿　培养瓶、培养皿和各种手术用刀、剪等。

（二）3T3细胞的传代培养

当3T3细胞生长接近融合时，作传代培养。步骤如下。

1．弃去培养液，用PBS平衡盐溶液冲洗2次。

2．加入胰蛋白酶－EDTA消化液，在37℃孵育5min，或倒置显微镜下观察到细胞收缩变圆为止。

3．加入含血清的培养液终止消化，用吸管轻轻吹打、分散细胞。

4．用血细胞计数板计算细胞的数量，然后离心（1　500r／min，5min）。

5．按3×10－3个／cm2的细胞密度种植于培养瓶或培养皿中。注意细胞种植密度的高低可根据细胞融合的时间来确定。

6．细胞3～5d内发生融合。在3T3细胞接近融合时再次重复上述步骤进行细胞传代培养。

（三）饲养层细胞的制备

1．选择处于指数生长期的3T3细胞，当细胞生长接近50%融合时即更换培养液，继续培养24h。

2．在培养液中加入1～10μg的丝裂霉素C，再培养12h。

3．用培养液冲洗3次，最后一次于37℃再孵育10～20min。

4．按常规方法用胰蛋白酶消化收集3T3细胞，以2．5×104个／cm2的密度种植在培养瓶中，加入角质形成细胞培养液，液量为1ml／5cm2。

5．在培养箱中培养大约12h，细胞贴壁、铺展后，再种植角质形成细胞。

（四）角质形成细胞的原代培养

1．将外科手术切除下的皮肤置入皮肤标本转运液中。

2．在超净工作台内取出标本，在75%乙醇中快速浸洗3次。

3．用剪刀仔细剪去皮下脂肪组织及部分真皮，并修剪成宽2～3mm的条状。

4．用PBS漂洗2次，表皮面朝下浸于中性蛋白酶（Dispase）液中4℃过夜或37℃下消化2～4h。

5．从中性蛋白酶消化液中取出皮肤条，将其放入另一培养皿中，用两把眼科镊子将表皮与真皮分离开。撕下的表皮薄而半透明，真皮结缔组织由于吸收了水分而呈轻微肿胀的凝胶状。如果不易分离，则须进一步在中性蛋白酶消化液中继续孵育。一般4℃下过夜消化较少出现此类情况。

6．将分离的表皮条用胰蛋白酶溶液5ml，继续振荡消化5～10min，再加入5ml含10%胎牛血清DMEM终止消化。

7．经150目不锈钢滤网过滤，以1　500r／min离心10min，弃去上清，加入角质形成细胞培养液10ml，混匀，苔盼蓝染色计数。以（2～5）×104个细胞／cm2的密度种植于饲养层细胞表面。

（五）角质形成细胞的维护与传代培养

1．每周常规更换培养液2次。

2．随着培养时间的延长，部分饲养层细胞开始死亡和脱落，这时常常需要添加新的饲养层细胞。

3．原代角质形成细胞培养10～14d后开始融合。当生长的细胞覆盖了培养瓶底的70%～80%的面积时，开始进行传代培养。

4．细胞传代用胰蛋白酶溶液消化传代。胰蛋白酶的消化时间为10～15min，并需振荡以使细胞脱壁。

5．细胞计数后，以（0．5～5）×104个细胞／cm2的密度种植在新的饲养层细胞上，也可以根据需要融合时间来决定细胞种植密度。生长良好的第二代角质形成细胞一般在7～10d内融合。

二、角质形成细胞的无血清、无饲养层培养

（一）材料

1．皮肤来源　同上。

2．培养液　角质形成细胞培养基（GIBCO，USA），2～8℃保存；使用时添加50μg／ml牛垂体提取物（BPE）50μg／ml，人重组表皮细胞生长因子（rEGF）5ng／ml，添加剂于－5～－20℃冷冻保存。

3．其他培养用液（GIBCO，USA）

（1）0．05%胰蛋白酶－0．53mM　EDTA： 0．05%胰蛋白酶与0．53mmol／L　EDTA· 4Na溶液1∶1（V／V）等量混合消化液。

（2）大豆胰酶抑制剂：浓度为10mg／ml，溶解于无钙、镁PBS缓冲盐溶液中，过滤消毒，－20℃冷冻保存。

（3）中性蛋白酶（dispaseⅡ）：浓度为5mg／ml，溶解于无钙、镁PBS缓冲盐溶液中，过滤消毒，－20℃冷冻保存。

（4）Versene：Versene为0．53mmol／L EDTA·4Na溶液的商品名，按0．2g／L的浓度溶于无钙镁PBS缓冲盐溶液中，过滤消毒，2～8℃保存。

4．培养器皿　培养瓶、培养皿和各种手术用刀、剪等。

（二）表皮角质形成细胞的分离与原代培养

1．手术切除的皮肤标本置入含有庆大霉素（浓度为5μg／ml）的角质形成细胞培养液中。

2．在超净工作台内取出皮肤标本，用含有庆大霉素（浓度为20μg／ml）的无钙、镁PBS缓冲盐溶液冲洗。

3．用剪刀仔细剪去皮下脂肪组织及部分真皮，并修剪成宽2～3mm的条状，用无钙镁PBS漂洗2次，表皮面朝上浸于0．5%中性蛋白酶中消化4℃下18h。

4．18h后，用两把眼科镊子将表皮从真皮上撕下，剪成碎片，再用0．05%胰蛋白酶－0．53mmol／L　EDTA在37℃消化15min，10ml大豆胰酶抑制剂终止消化。

5．经150目不锈钢滤网过滤，以1　500r／min离心10min，弃去上清，加入角质形成细胞培养液10ml，混匀，苔盼蓝染色计数。

6．按3×106／75cm2密度接种培养，加入角质形成细胞培养基（5ml／25cm2）在37℃，5%CO2，100%相对湿度的培养箱中培养，培养液3d换1次。一般原代培养7～10d接近融合。

（三）表皮角质形成细胞的传代培养

1．当细胞融合到60%～75%密度时，吸出培养液，用10ml无钙镁PBS冲洗。

2．经0．05%胰酶0．53mmol／L　EDTA 37℃消化5～10min，当在倒置显微镜下观察到90%的细胞收缩变圆时，加入10ml胰酶抑制剂终止消化，轻轻吹打。

3．将细胞悬液移入离心管中，1　500r／min离心10min。

4．弃去上清液，加入角质形成细胞培养液10ml，混匀，计数，按1∶3的比例传代培养。

5．2～3d换1次培养液，直到细胞融合至60%～75%密度时，再传代培养。

三、表皮角质形成细胞的生长

生物学特点

体外培养表皮角质形成细胞的形态结构与体内有很大的相似性，表皮角质形成细胞的形态和一些特殊结构可以重现。但由于体内、外生长环境的不同，细胞分化的特性和程度不一，体外培养表皮角质形成细胞的形态结构和体内细胞仍然有一定差异。

用一般光学显微镜观察体外培养的角质形成细胞，在构造和生物学形状上与体内细胞有着极大的相似性。体外培养的表皮角质形成细胞呈多角形，常呈集落式生长，镶嵌排列，融合后呈现典型的“铺路石样”。细胞的均质性和透明性很强，结构不明显。用相差显微镜能看清楚细胞的轮廓和内部结构，而细胞中的细胞器等结构需结合固定染色或特殊技术才能显示。此外，细胞的形态特征与培养液中的营养物质的多少有关，当培养液中营养物质被耗竭导致细胞生长状态不佳时，细胞轮廓增强，反差增大，且胞质中出现颗粒、脂滴和空泡等，出现细胞代谢不良等形态表现。如果细胞传代次数再增加或在体外生活时间延长，细胞形状会更加不规则，甚至出现双核或多核的现象，细胞的贴壁能力也大大降低（图4－13，彩图14）。

图4－13　表皮角质形成细胞原代接种后7～10d，细胞呈镶嵌状紧密排列，单个细胞为多角形，融合后呈现“铺路石样”（倒置相差显微镜，×100）

电镜下观察体外培养的表皮角质形成细胞，表面可见许多微绒毛。在融合后的角质形成细胞相邻面，常常形成特殊的细胞间连接——桥粒（图4－14）。体外培养角质形成细胞核的超微结构与体内细胞并无多大区别，细胞核圆形或卵圆形，位于中央。各种细胞器的形态结构与体内细胞相似，但随着体外培养时间的延长，细胞器的结构和数量会发生一定改变。此外，电镜下观察体外培养的角质形成细胞，其胞质内还可以见到一些特征性的细胞器或包含物，如角蛋白颗粒、张力细丝等（图4－15）。

图4－14　扫描电镜观察：表面角质形成细胞镶嵌状排列，表面可见许多微绒毛（×800）

图4－15　培养细胞透射电镜照片：细胞器正常，胞质内分布有大量角蛋白颗粒和成束排列的张力丝（×9　700）

四、讨　　论

1．皮肤的取材和无菌处理　皮肤与外界环境直接接触，都存在着不同程度的细菌等微生物的污染，尽管在外科手术时已采取了较严格的消毒措施，但用于细胞培养的标本仍需作进一步的处理。乙醇浸洗对取材后皮肤的消毒灭菌十分重要，在汗腺、皮脂腺孔周围的微生物经过乙醇消毒一般都可以杀灭去除。多数情况下，皮肤标本还需经过含有较高浓度抗生素的缓冲液漂洗数次。皮肤材料需尽可能新鲜，取材后应立即进行细胞分离培养，否则，要将皮肤置于皮肤标本储运液中2～8℃下保存，有文献报道最多可以保存5d，并且仍能维持较好的细胞活力。在皮肤材料来源上，材料来源的个体越年轻，角质形成细胞的生长潜能越大。一般来说，用于培养的皮肤材料应尽可能来源于年轻个体，以年龄小于16岁为好，不要超过60岁。

2．关于3T3饲养层细胞的维护　3T3细胞在培养过程中，要注意以下几个问题：①首要的是防止3T3细胞过度融合，以免造成3T3细胞对丝裂霉素C或对射线处理的抗性，而使3T3细胞保持了活跃的增殖能力干扰了角质形成细胞的生长。②在用丝裂霉素C或γ射线照射处理3T3细胞时，其作用剂量都应进行滴定或测试。经过处理的作为角质形成细胞饲养层的3T3细胞应该是有活力贴壁铺展，但不再具有分裂增殖的能力。③合适的3T3细胞种植密度对促进角质形成细胞的增殖与分化，以及抑制成纤维细胞的生长相当重要，应该以能覆盖培养面积的70%为宜。

3．在角质形成细胞完全融合前进行传代培养相当重要，否则，角质形成细胞将形成复层而丧失通透性，使基底细胞营养供应缺乏，最终导致复层生长的角质形成细胞死亡或进行分化。最适宜的传代时间是当细胞生长至覆盖培养面积的70%时。

（上海第二医科大学第九人民医院　崔　磊　杨光辉）

参　考　文　献

1　成令忠主编 ．组织学 ．北京：人民卫生出版社，1994

2　鄂　征主编 ．组织培养和分子细胞学技术 ．北京：北京出版社，1995

3　薛庆善主编 ．体外培养的原理与技术 ．北京：科学出版社，2001

4Rheinwald　JG，Green　H．Serial　cultivation　of strains　of　human　epidermal　keratinocytes：the formation　of　keratinizing　colonies　from　single cells．Cell，1975；6：331－334

5Rheinwald　JG，Green　H．Epidermal　growth　factor　and　the　multiplication　of　cultured　human　epidermal　keratinocytes．Nature，1977；265，421－424

6Green　H，Kehinde　O，Thomas　J．Growth　of cultured　human　epidermal　cells　into　multiple　epi－thelia　suitable　for　grafting．Proc．Nat．Acad．Sci．U．S．A．1979；76：5665－5668

7O′Connor　NE，Mulliken　JB，Banks－Schlegel　S，et　al．Grafting　of　burns　with　cultured　epithelium prepared　form　autologous　epidermal　cells．Lancet，1981；1：75

8Linge　C．Establishment　and　maintenance　of　normal　keratinocyte　cultures．In：Gareth　E，Jones GE，eds．Human　cell　culture　protocols．Totowa：Humana　press．1996；1－9