（一）标本采集及处理和运输
采集时间最好是病程早期、急性期或症状典型时；无菌采集，标本应无外源性污染，采集标本盛于无菌容器内，盛标本容器须先经高压灭菌、煮沸、干热等物理方法灭菌，或一次性无菌容器，而不能用消毒剂和酸类处理；采集量不应过少，并注意采集的关键性和代表性。当疑有感染时，及时采集如化脓性病灶采取浓汁、渗出物；疑为败血症采取血液等，不同检材如痰液、脓汁、血液、呕吐物及粪便等，或考虑做纤维支气管镜检查取分泌物培养或进行组织活检。
采集后立即送检，标本保存在4℃不应超过24h。专人运送，注意包装，防止外泄。
（二）直接涂片染色镜检
取标本涂片，革兰染色后镜检，根据细菌形态，排列和染色性可作出初步诊断。
1．结核分枝杆菌 结核分枝杆菌简称结核杆菌（Tubercle bacilli），于1882年由德国细菌学柯赫（Koch）发现并证明是结核病的病原菌。结核分枝杆菌菌体细长，稍弯曲，两端钝圆，大小为（0．2～0．5）μm×（1～5）μm。革兰染色不易着色，抗酸染色呈红色。以痰液直接涂片，结核分枝杆菌多为单个存在，有时呈“V，Y，人”字形排列，痰液量多时可排列为束状或积聚成团。荧光染料金铵“O”染色，在荧光显微镜下观察呈金黄色荧光。
2．葡萄球菌属（Staphylococcus） 是一群革兰阳性球菌，因常堆聚成葡萄串状，故名。多数为非致病菌，少数可导致疾病。器官移植术后致病菌主要是甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌（MRSA）较多。其形态染色：球形或稍呈椭圆形，直径1．0μm左右，排列成葡萄状。葡萄球菌无鞭毛，不能运动。无芽胞，除少数菌株外一般不形成荚膜。易被常用的碱性染料着色，革兰染色为阳性。其衰老、死亡或被白细胞吞噬后，以及耐药的某些菌株可被染成革兰阴性。如为革兰阳性球菌呈葡萄状排列可初步报告为：“查见革兰阳性葡萄状球菌，疑为葡萄球菌”。直接涂片查见革兰阳性球菌。
3．肠球菌属 肠球菌属拉丁学名（Enterococcus thiercelin and jouhaud，1984）是人类肠道中的正常菌群，为革兰阳性，成双或短链状排列的卵圆形球菌，无芽胞，无夹膜，部分肠球菌有稀疏鞭毛，大小为（0．6～2．0）μm×（0．6～2．5）μm。器官移植细菌感染常见于粪肠球菌（Enterococcus faecalis）和屎肠球菌（Enterococcus faecom）。
4．肺炎克雷伯菌 革兰阴性杆菌，大小为（0．3～0．6）μm×（0．6～6．0）μm，球杆状，单个、成双或短链排列，无鞭毛，有较厚的荚膜。多数有菌毛。
5．铜绿假单胞菌 铜绿假单胞菌，革兰染色阴性。形态为直或稍弯、两端钝圆的杆菌，大小为（0．5～0．8）μm×（1．5～3．0）μm。有1～3根单端鞭毛，运动活泼。临床分离的菌株常有菌毛和微荚膜，不形成芽胞。
6．大肠埃希菌 大肠埃希菌俗称大肠杆菌，革兰阴性短杆菌，大小为（1．1～1．5）μm×（2．0～6．0）μm，多数有周鞭毛，能运动，有菌毛、夹膜及微夹膜。
7．鲍曼不动杆菌 革兰染色为阴性杆菌，菌体大小为（1．5～2．5μm）×（1．0～1．5μm），常成双排列，革兰染色不易褪色，多数菌株有夹膜，无芽孢。
（三）分离培养与鉴定
1．葡萄球菌属
（1）分离培养：将标本接种于血琼脂平板，37℃甘露醇和高盐培养基中进行分离培养，致病性葡萄球菌的主要特点：凝固酶产生阳性，金黄色素，有溶血性，发酵甘露醇。营养要求不高，在普通培养基上生长良好，在含有血液和葡萄糖的培养基中生长更佳，需氧或兼性厌氧，少数专性厌氧。28～38℃均能生长，致病菌最适温度为37℃，pH为4．5～9．8，最适为7．4。在肉汤培养基中24h后呈均匀浑浊生长，在琼脂平板上形成圆形凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润，不透明的菌落。不同种的菌标产生不同的色素，如金黄色、白色、柠檬色。色素为脂溶性。葡萄球菌在血琼脂平板上形成的菌落较大，有的菌株菌落周围形成明显的全透明溶血环（β溶血），也有不发生溶血者。凡溶血性菌株大多具有致病性。孵育后挑选可凝菌落进行涂片、染色、镜检。
（2）鉴定试验：多数葡萄球菌能分解葡萄糖、麦芽糖和蔗糖，产酸不产生气。致病性菌株能分解甘露醇。致病性葡萄菌的鉴定主要根据产生凝固酶和耐热核酸酶，产生金黄色色素，有溶血性。
触酶试验；即过氧化氢酶试验，细菌产生的过氧化氢酶催化过氧化氢溶液生成水和氧气，产生气泡。方法：取营养琼脂上的菌落置于洁净试管或玻片内，滴加3%H2O2溶液数滴，或直接滴加3%H2O2于不含血液的细菌培养物中，观察结果，如1min内产生大量气泡为阳性，相反为阴性。葡萄球菌为阳性。
血浆凝固酶试验：血浆凝固酶是金黄色葡萄球菌产生的一种与其致病力有关的侵袭性酶，使血浆中的纤维蛋白在菌体表面沉积和凝固以阻碍吞噬细胞的吞噬。有试管法和玻片法两种方法。玻片法：兔血浆和盐水各1滴，分别置于洁净的玻片上，挑取被检菌分别与血浆和盐水混合。有商品化乳胶凝集试验。试管法：取试管2支，各加0．5ml人或兔血浆，挑取被检菌和阳性对照菌分别加入血浆中并混匀，于37℃水浴3～4h。玻片法以血浆中有明显的颗粒出现而盐水中无自凝现象判为阳性；试管法以血浆凝固判为阳性。
耐药性检测：耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌（MRSA）。
型别鉴定：细菌核糖体基因分型法（ribotyping），质粒指纹图谱分型法等。
（3）葡萄球菌肠毒素检查：近年来，免疫学方法检测葡萄球菌肠毒素如ELISA，特异的DNA基因探针杂交技术检测葡萄球菌是否为产肠毒素菌株。
2．肠球菌属
（1）分离培养：革兰阳性，在液体培养基中呈成对或短链。不生芽胞，有时以鞭毛运动，没有明显的荚膜，兼性厌氧，或能异养，发酵代谢，可发酵的糖类范围广泛，主要产L－乳酸，但不产气，最终pH4．2～4．6，营养需要复杂。接触酶阴性。通常在10～45℃能生长（最适37℃），在pH9．6，6．5%NaCl中和40%胆盐中也能生长。很少还原硝酸盐，通常发酵乳糖。
（2）鉴定试验：有2种方法。
触酶试验：阴性。
氧化酶试验：氧化酶是细胞色素呼吸酶系统的最终呼吸酶，具有氧化酶的细菌，首先使细胞色素C氧化，再由氧化的细胞色素C使对苯二氨氧化，生成有色的醌类化合物。常用方法有2种。菌落法：直接滴加试剂于被检菌菌落上。滤纸法：取洁净滤纸一小块，沾取菌少许，然后加试剂。结果判定：细菌在与试剂接触10s内呈深紫色，为阳性。
3．肺炎克雷伯菌
（1）分离培养：标本接种于选择性培养基，血液标本经增菌后与其他标本接种于血平板。37℃18～24h后，取菌落染色涂片。肺炎克雷伯菌营养要求不高，能在营养琼脂上生长。在血琼脂平板上形成隆起、大而黏液样菌落，相邻菌落易融合成鼻涕样菌苔，接种针挑取时呈丝状粘连，连续传代可变为光滑型菌落。在液体培养基中浑浊生长。
（2）鉴定试验：脲酶、丙二酸盐阳性。
荚膜肿胀试验是本属菌的主要鉴定依据。方法：将菌种接种于华－佛培养基，37℃18～24h后，取1滴培养物于载玻片，加墨汁或亚甲蓝液1滴，再加特异性抗血清1接种环，混合盖上盖玻片镜检。菌体周围空白圈大于对照者为阳性。
4．铜绿假单胞菌
（1）分离培养：血液及体液标本可先增菌后在转种血琼脂和麦康凯琼脂，浓液、分泌物等可直接接种上述培养基分离培养。
铜绿假单胞菌为专性需氧菌。最适生长温度35℃，在41℃也能生长，在4℃不生长是铜绿假单胞菌的一个特点。营养要求不高，直接接种于血琼脂平板，生长后根据落大小、色素及生化反应等鉴定。在普通培养基上生长良好，菌落大小不一，平均直径2～3mm，扁平，边缘不整齐、扁平、隆起、光滑、湿润的菌落，且常呈相互融合状态。由于本菌产生水溶性色素，使培养基被染成蓝绿色或黄绿色。在血琼脂平板上菌落较大、扁平、湿润、有金属光泽和生姜气味，呈灰绿色或蓝绿色，菌落周围形成透明溶血环。在肉汤中形成菌膜，肉汤澄清或微浑浊，菌液上层呈绿色。培养在pH8．0的碱性环境中，有自溶现象。感染伤口时形成绿色脓液。
（2）鉴定试验：分解葡萄糖，产酸不产气，氧化酶阳性，不形成吲哚。硝酸盐还原试验、明胶液化、精氨酸双水解酶均为阳性。
硝酸盐还原试验：被检菌接种于硝酸盐培养基中，于35℃培养1～4d，将对氨基苯磺酸0．8g＋5mol／L醋酸100ml，α－奈胺0．5g＋5mol／L醋酸100ml等量混合后（约1ml）加入培养基内，立即观察结果，出现红色为阳性。
明胶液化试验：被检菌穿刺接种于明胶培养基，于22℃培养7d，逐日观察结果。35℃孵育在观察结果前，先置4℃冰箱内30min，再看结果。培养基呈液化状态为阳性。
5．大肠埃希菌
（1）分离培养：肠外感染采取中段尿、血液、脓液等，腹泻取粪便。大肠埃希菌对营养要求不高，在普通营养肉汤中成浑浊生长。血液接种肉汤增菌，待生长后再移种于血琼脂平板，35～37℃18～24h观察菌落形态。普通营养琼脂上，呈圆形，凸起，边缘整齐，灰白色的光滑型菌落，直径2～3mm。血琼脂平板上，少数菌株产生溶血环。在伊红亚甲蓝琼脂上，由于发酵乳糖，菌落呈蓝紫色并有光泽，麦康凯和SS琼脂中的胆盐对其有抑制作用，形成粉红色菌落。
（2）鉴定试验：大多数菌株能发酵乳糖产酸或产酸产气，产生吲哚，甲基红试验阳性，V－P试验阴性，不分解尿素、不利用枸橼酸盐、肌醇、苯丙氨酸脱氨和葡萄糖酸盐、氧化酶试验等试验均为阴性。一般不产生硫化氢。
吲哚试验：具有色氨酸酶的细菌，能分解蛋白胨水中的色氨酸生成吲哚，当加入吲哚试剂后则形成红色的玫瑰吲哚。将待测菌接种于培养基中，于35℃培养24～48h，沿试管壁慢慢加入吲哚试剂。于两者液面接触处出现红色为阳性，无色为阴性。
甲基红试验：将待测菌接种于培养基中，培养2～3d，于培养基内加入甲基红试剂，立刻观察结果。呈现红色为阳性；橘红色为弱阳性；黄色为阴性。
V－P试验：将待测菌接种于培养基中，35℃培养2d后，加入6%α－萘酚乙醇溶液和40%KOH，振摇。数分钟内出现红色为阳性。
血清学鉴定：EPEC的的血清学鉴定，用特异O及H抗血清特异血清型，亦可以ELISA和细胞培养法来检测。
6．鲍曼不动杆菌
（1）分离培养：营养要求不高，专性需氧菌，在普通琼脂及麦康凯琼脂培养基生长良好，最适生长温度为35℃，42℃也可生长。血琼脂平板上菌落为灰白色、圆形凸起、光滑、边缘整齐。在麦康凯琼脂平板上形成粉红色菌落。
（2）鉴定试验：氧化酶阴性，触酶阳性，葡萄糖O／F为氧化型。动力、吲哚、甲基红、V－P及H2S和硝酸盐还原试验阴性。
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