琼脂培养基的灭菌方法

实验一　培养基的配制

一、目的要求

1.明确培养基的配制原理。

2.通过对基础培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤。

二、基本原理

牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。由于这种培养基中含有一般细菌生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供微生物生长繁殖之用。基础培养基含有牛肉膏、蛋白胨和NaCl。其中牛肉膏为微生物提供碳源、能源、磷酸盐和维生素，蛋白胨主要提供氮源和维生素，而NaCl提供无机盐。在配制固体培养基时，还要加入一定量的琼脂作凝固剂。琼脂在常用浓度下96℃时溶化，实际应用时，一般在沸水浴中或下面垫以石棉网煮沸溶化，以免琼脂烧焦。琼脂在40℃时凝固，通常不被微生物分解利用。固体培养基中琼脂的含量根据琼脂的质量和气温的不同而不同。由于这种培养基多用于培养细菌，因此要用稀酸或稀碱将其pH调至中性或微碱性，以利于细菌的生长繁殖。

1.牛肉膏蛋白胨培养基

牛肉膏蛋白胨培养基的配方如下:牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，水1 000mL，pH 7.4～7.6。

2.结冷胶发酵培养基

（1）斜面培养基:葡萄糖3.0g，蛋白胨0.5g，酵母浸粉0.3g，琼脂2.0g，NaCl 0.5g，蒸馏水100mL，调节pH 7.0。121℃，灭菌20min。

（2）种子培养基:葡萄糖2.0g，蛋白胨0.5g，牛肉膏0.3g，酵母浸粉0.1g，蒸馏水100mL，调节pH 7.0。121℃，灭菌20min。

（3）发酵培养基:蛋白胨0.5g，酵母浸粉0.3g，NaCl 0.3g，适量的碳源，盐溶液0.1mL，蒸馏水100mL，调节pH 7.0。121℃，灭菌20min。

（4）发酵培养基中所用盐溶液组成为（去离子水1 000mL）:MnCl₂·4H₂O 1.8g，FeSO₄·7H₂O 2.487g，H₃BO₃0.285g，CuCl₂0.027g，ZnCl₂0.021g，CoCl₂·6H2O 0.074g，NaMoO₄0.023g，二水酒石酸钠2.1g。

（5）碳源优化实验中所用碳源及加量分别为:淀粉3.0g，甘露醇3.0g，蔗糖3.0g，麦芽糖3.0g，乳糖3.0g。

三、器材

（1）溶液或试剂:培养基所需各试剂，琼脂，1mol/L NaOH，1mol/L HCl。

（2）仪器或其他用具:试管，三角瓶，烧杯，量筒，玻棒，培养基分装器，天平，牛角匙，pH试纸（5.5～9.0），牛皮纸，记号笔，封口膜，皮筋，试管帽等。

四、操作步骤

1.称量

按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入烧杯中。牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯。也可放在称量纸上，称量后直接放入水中，这时如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。

蛋白胨很容易吸湿，在称取时动作要迅速。另外，称药品时严防药品混杂，一把牛角匙用于一种药品；或称取一种药品后，洗净，擦干，再称取另一药品。瓶盖不要盖错。

2.溶化

在上述烧杯中先加入少于所需的水量，用玻棒搅匀，然后在石棉网上加热溶解，或在磁力搅拌器上加热溶解。待药品完全溶解后，补充水到所需的总体积。如果配制固体培养基，需将称好的琼脂放入已溶的药品中，再加热溶化，最后补足所损失的水分。在制备用三角瓶盛固体培养基时，一般可先将一定量的液体培养基分装于三角瓶中，然后按1.5%～2.0%的量将琼脂直接分别加入各三角瓶中，不必加热溶化，而是灭菌和加热溶化同步进行，节省时间。在琼脂溶化过程中，应控制火力，以免培养基因沸腾而溢出容器。同时需不断搅拌，以防琼脂糊底烧焦。配制培养基时，不可用铜或铁锅加热溶化，以免离子进入培养基中，影响细菌生长。

3.调节pH

在未调节pH前，先用精密试纸或pH计测量培养基的原始pH，如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/L NaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH，直至pH达7.0。反之，用1mol/L HCl进行调节。对于有些要求pH较精确的微生物，其pH的调节可用酸度计进行（可参考有关说明书上的使用方法）。

pH不要调节过头，以避免回调而影响培养基内各离子的浓度。配制pH低的琼脂培养基时，若预先调好pH并在高压蒸汽下灭菌，则琼脂因水解不能凝固。因此，应将培养基的成分和琼脂分开灭菌后再混合，或在中性pH条件下灭菌，再调整pH。

4.过滤

趁热用滤纸或多层纱布过滤，以利于观察某些实验结果。一般无特殊要求的情况下，这一步可以省去（本实验无须过滤）。

5.分装

按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶内。

（1）液体分装

分装高度以试管高度的1/4左右为宜。分装三角瓶的量根据需要而定，一般以不超过三角烧瓶容积的一半为宜，如果是用于振荡培养用，则根据通气量的要求酌情减少；有的液体培养基在灭菌后，需要补加一定量的其他无菌成分，如抗生素等，其装量一定要准确。

（2）固体分装

分装试管，其装量不超过管高1/5，灭菌后制成斜面。分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。

（3）半固体分装

一般以试管高度1/3为宜，灭菌后垂直待凝。分装过程中，注意不要使培养基沾在管（瓶）口上，以免沾污棉塞而引起污染。

6.加塞

培养基分装完毕后，在试管口或三角烧瓶口上加上封口膜，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能。

7.包扎

加塞后，将全部试管用麻绳捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期。三角烧瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结形式扎好，使用时容易解开，同样用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期（有条件的实验室，可用市场上销售的铝箔代替牛皮纸，省去用绳扎，而且效果好）。

8.灭菌

将上述培养基以0.103MPa，121℃，20min高压蒸汽灭菌。

9.搁置斜面

将灭菌的试管培养基冷至50℃左右（以防斜面上冷凝水太多），将试管口端搁在玻棒或其他合适高度的器具上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜（如图2-1所示）。

图2-1　斜面摆放示意图

10.无菌检查

将灭菌培养基放入37℃的温室中培养24～28h，以检查灭菌是否彻底。

五、实验报告

1.思考题

（1）培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的培养基是无菌的？

（2）在配制培养基的操作过程中应注意些什么问题？为什么？