大肠杆菌的平板菌落计数

实训14　大肠杆菌的平板菌落计数

一、实训目的

（1）学习平板菌落计数的基本原理和方法。

（2）熟练掌握倒平板技术和系列稀释操作技术。

二、实训原理

平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释，使其中的微生物充分分散为单个细胞，取一定量的稀释液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成的肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，长成的一个单菌落也可能来自样品中的2～3个或更多个细胞，因此平板菌落计数的结果往往偏低。现在常使用菌落形成单位（colony－forming unit，CFU）。

该计数法的缺点是操作较烦琐，需要培养一段时间才能取得，而且测定结果易受多种因素的影响。但是这种计数方法最大的优点是可以获得活菌的信息，所以被广泛用于生物制品检验，以及食品、饮料和水等含菌指数或污染度的检测。

三、实训器材

1．材料

大肠杆菌悬液、LB培养基。

2．器具

1mL、5mL无菌吸管，无菌培养皿，无菌水，无菌试管，试管架和记号笔等。

四、实训步骤

1．编号

取无菌培养皿9套，分别标明为10^－4、10－5、10－6各3套。另取6支盛有4．5mL无菌水的试管，排列于试管架上，分别标记为10－1、10－2、10^－3、10^－4、10^－5、10^－6。

2．稀释

用1mL无菌吸管吸取1mL已充分混匀的大肠杆菌悬液，精确地放0．5mL至10－1试管中，此即为10倍稀释。注意放液时吸管尖端不要碰到液面，将试管充分振荡、混匀。另取一支1mL吸管插入10^－1试管中来回吹吸菌液三次，进一步将菌体分散、混匀。动作不要太猛太快，吸时插入，吹时提出，再用此吸管吸取10－1菌液1mL，精确地放0．5mL至10^－2试管中，此即为100倍稀释，依次类推。

3．取样

用三支1mL无菌吸管分别吸取10^－4、10^－5、10^－6的稀释菌液各0．2mL，对应放入编好号的无菌培养皿中。

4．倒平板

尽快向上述盛有不同稀释浓度的菌液的培养皿中倒入熔化后冷却至45℃的LB培养基15～20mL，置水平位置迅速旋动培养皿，使培养基与菌液混合均匀。

5．培养

将平板倒置于37℃培养箱中恒温培养48h。

6．计数

算出同一稀释度三个平板上的菌落平均数，并按下列公式进行计算：

每毫升中菌落形成单位（CFU／mL）＝同一稀释度三次重复的平均菌落数×稀释倍数×5

五、结果记录

将培养后菌落计数结果填入表3－8。

表3－8　菌落计数结果统计表

六、思考题

（1）为什么熔化后的培养基要冷却至45℃左右才能倒平板？

（2）要使平板菌落计数准确，需要掌握哪几个关键操作？为什么？

（3）同一种菌液用血球计数板和平板菌落计数法同时计数，所得结果是否一样？为什么？

（4）试比较平板菌落计数法和显微镜下直接计数法的优缺点。