细菌培养基

时间：2022-11-14 百科知识版权反馈

【摘要】：培养细菌必须有适于细菌生长繁殖的培养基。培养基中通常含有能被细菌利用的碳源、氮源、无机盐和水等物质。同一种类的培养基，因原料品种的不同而有质量上的差异。因此选择用于特殊要求的合适培养基，需要有相当丰富的工作经验。已有市售亚硒酸盐干粉培养基出售，加水，溶解，灭菌后即可用。

第一节　细菌培养基

培养基是按照微生物的生长要求配制成的一种人工营养制品，主要作为繁殖细菌微生物、分离细菌微生物、鉴定细菌微生物、保存和研究细菌微生物以及制造生物制品等用。培养细菌必须有适于细菌生长繁殖的培养基。不同种类的细菌对营养的要求有显著的差别。培养基是用人工的方法，将多种营养物质根据各种细菌生长的需要而合成的一种混合营养料。培养基中通常含有能被细菌利用的碳源、氮源、无机盐和水等物质。一般说来，微生物对未经消化的蛋白质利用率较差，因此需要比较简单的含氮物质，如氨基酸、蛋白胨、蛋白及多肽类等。某些细菌更需要类似维生素类的辅助生长因素或其他某些特殊因子才能生长。因此要培养好细菌，首先要掌握细菌生长需要的条件，以便去制备各种培养基。

随着微生物的发展，培养基的种类与日俱增。同一种类的培养基，因原料品种的不同而有质量上的差异。因此选择用于特殊要求的合适培养基，需要有相当丰富的工作经验。为了保证工作质量，节约制备大量品种培养基的时间，目前通常采用现成的各种干粉培养基成品，用蒸馏水配制而成，此种培养基使用方便。制备培养基时必须注意如下事项：①培养基必须含有细菌所需的各种营养物质，如蛋白胨、碳水化合物及盐类；②培养基必须含有合适的水分，因为细菌主要靠液体以弥散和渗透等方式摄取营养；③多数致病菌对酸碱值的变化均敏感，故所用的培养基需要调整pH值，通常为pH值7.2～7.6，即适合多数细菌的生长。测pH须在冷后测定，因培养基所含成分不同，在冷或热时测定pH值相差较大；④制造及装培养基的容器不应含有抑制细菌生长繁殖的物质，制造培养基的容器最好用搪瓷锅和铝锅，不用铜锅与铁锅；⑤制造培养基所用化学药品，均需化学纯以上，且各种成分要准确称量；⑥制造的培养基应均质透明；⑦培养基必须彻底灭菌，且应杂检。下面介绍一些常用的培养基及其制备方法。

一、普通培养基

（一）营养肉汤（Beef infusion broth）

制备方法：取定量牛肉浸液，加入其他各成分，加热溶化，补足失去水分。调pH值到7.2～7.6（每升加0.1N NaOH约20ml），滤纸过滤，分装；121℃15min～20min消毒灭菌，4℃冰箱保存备用。

用途：供一般细菌生长的液体培养基，生长后可检查其生长情况（混浊度、沉淀、菌膜等）也是制作固体培养基的基础培养基。

（二）肉膏汤（Beef extract broth）

制备方法：将上述各成分混合，加热溶化，调整pH值到7.4～7.6，过滤分装，121℃15～20min消毒灭菌，4℃冰箱保存备用。

用途：同营养肉汤。

（三）马丁肉汤（Martin’s broth）

制备方法：猪胃消化液，取去脂肪并绞碎的猪胃200g，加蒸馏水1000ml，浓盐酸10ml，置50℃～60℃水浴中消化18～24h，取出后100℃10～20min煮沸使消化停止。放冰箱24h，弃去上浮脂肪，吸取上清液，纱布过滤。经流动蒸汽消毒器中加热30～40min，调整pH值为8.2，过滤分装，121℃灭菌20min。

取等量猪胃消化液和普通肉汤混合，煮沸10min，调整pH值到7.6～7.8，分装，115℃灭菌30min，4℃冰箱保存备用。

用途：用于培养猪丹毒杆菌及营养要求较高的细菌。

（四）营养琼脂（Nutrient agar）

制备方法：将琼脂加入到营养肉汤中，加热使之融化；调pH值到7.2～7.6；用纱布过滤，分装，121℃灭菌20min，4℃冰箱保存备用。

用途：一般细菌培养、菌种保存或供制备血液琼脂等培养基的基础。

（五）半固体（Semisolid agar）培养基

制备方法：将琼脂加入到营养肉汤中，加热使之融化；调pH值到7.6；用纱布过滤，分装，121℃灭菌15min～20min，4℃冰箱保存备用。

用途：用于菌种保存，细菌运动性观察。

（六）血液琼脂（Blood agar）

无菌鲜血的制备：以无菌操作采取健康动物（通常是绵羊或家兔）血液，加到盛5%柠檬酸钠溶液的容器中（血与抗凝剂之比为9∶1），混匀；或加到盛有灭菌玻璃珠的容器里，反复摇动多次制成脱纤血，置冰箱中备用。

将灭菌的营养琼脂加热融化，冷却至45℃～50℃时，加入5%～10%无菌鲜血（一般为绵羊或兔血），分装试管，摆成斜面或倾注于平皿，待凝固后，置37℃培养1～2d，有污染者废弃，无菌者保存于4℃冰箱备用。

用途：用于营养要求较高细菌的分离培养及观察细菌的溶血作用。

（七）厌气肉肝汤（Anaerobi broth with liver）

小肝块1/10，液体石蜡适量。

制备方法：取除脂肪与筋膜的牛肉，用绞肉机绞碎，加入切成100g左右的肝块各一块，加蒸馏水4份；煮沸30～60min，补足失去的水分，用白布过滤，弃去肉渣，取出肝块，滤液加入蛋白胨1%和氯化钠，加热溶化；将煮过的肝块洗净，切成小方块，用蒸馏水充分冲洗后，分装于试管中或中性玻璃瓶内，其量约为预计分装肉肝汤量的1/10；将滤液分装于含有肝块的中型容器中（如为试管，还应加适量的液体石蜡），以121℃高压灭菌30min。

用途：供一般厌气菌培养与无菌检验应用。

（八）石蕊牛奶培养基

制备方法：取精制石蕊颗粒1g加蒸馏水60ml，使充分溶解，用粗滤纸滤后制成石蕊溶液。取新鲜牛奶，脱去乳脂；加入石蕊溶液，使之成淡紫色；分装于试管中，可加适量液体石蜡；115℃高压灭菌20min。

用途：用于一般细菌鉴定之用。用于厌氧菌的鉴定可加适量液体石蜡。

二、特殊培养基

（一）用于肠道菌的培养基

1.麦糠凯（Macconkey）琼脂

制备方法：除中性红水溶液外，其余各成分混合于锅内加热溶解。调pH值到7.2～7.4，煮沸，用脱脂棉过滤。加入1%中性红水溶液，摇匀，121℃高压灭菌15min。冷却至50℃，倾倒平皿。平皿内培养基凝固后，置温箱内烤干表面水分即可应用。可保存于4℃冰箱内。也可用厂家专门配制、出售的麦糠凯琼脂干粉剂，用时，加水溶解，灭菌。

用途：肠道致病菌的分离。对乳糖发酵菌的菌落呈红色。不发酵的沙门氏菌和痢疾杆菌呈无色透明。

2.三糖铁琼脂（Triple Sugar iro nagar）

制备方法：各成分混合后加热煮沸溶解。调pH值到7.2～7.4，分装于容积15ml的试管，每管10ml，121℃高压灭菌15min。趁热放置成底层约2.5cm高的斜面。也可用厂家专门配制、出售的三糖铁琼脂干粉剂，用时，加水溶解，灭菌即可。

用途：从选择性平板上挑可疑菌落接种于此培养基上作纯培养，观察葡萄糖、乳糖、蔗糖的发酵反应，并可观察H₂S的产生。常用于肠杆菌科生化鉴定。

3.SS琼脂

制备方法：除中性红与亮绿溶液外，其余各成分混合于锅内加热溶解。调pH值到7.0～7.2，煮沸，用脱脂棉过滤。加入中性红与亮绿溶液，摇匀，加热煮沸溶解。冷却至45℃，倾倒平皿。制备好的培养基应在2～3d内用完。亮绿溶液配好后置于暗处，于一周内用完。也可用厂家专门配制、出售的SS琼脂干粉剂，用时，加水溶解，灭菌即可。

用途：肠道致病菌的分离。本培养基不能高压灭菌或加热过久。平板使用前应倒置培养箱中烘干。

4.增菌培养基（缓冲蛋白胨水）

制备方法：各成分混合后加热煮沸溶解，分装，121℃高压灭菌15min即可。

用途：用于分离沙门氏菌等肠道菌的增菌培养基。也可用厂家专门配制、出售的干粉剂，用时，加水溶解，灭菌即可。

5.亚硒酸盐培养基

制备方法：上述各成分除亚硒酸钠外，混合加热100℃，10～15min，冷却至40℃～50℃时，加入亚硒酸钠，分装。已有市售亚硒酸盐干粉培养基出售，加水，溶解，灭菌后即可用。

6.H.E琼脂（Hektone肠道用培养基）

制备方法：上述各成分加热溶解，调pH值至7.2，加0.4%溴麝香草酚蓝16ml，Andrade指示剂20ml（蒸馏水100ml，酸性复红0.5g，1mol/L NaOH 16m1），即为基础液。其中加入甲液、乙液各20ml即为该培养基。现有干粉培养基供应市场。

［附］甲液：硫代硫酸钠34g，枸橼酸铁铵4g，加水至100ml，煮沸灭菌。

　　　乙液：去氧胆酸钠10g，加水至l00ml，煮沸灭菌。

用途：分离培养肠道致病菌用。

7.四硫磺盐培养基

制备方法：将上述基础液各成分混合加热煮沸，可加入1∶100敦煌绿水溶液1ml，分装试管，每管10ml，121℃灭菌15min。临用前，加入碘液，每管0.2ml。每100ml培养基中还可加入0.125g碘胺噻唑，以防止变形杆菌的过度生长。

用途：沙门氏菌的增菌培养。

8.伊红－美蓝培养基（EMB）

制备方法：上述成分混合溶解后，调pH值至7.2，加入指示剂。121℃灭菌15min后，倾倒平皿备用。已有市售粉剂，加水溶解，灭菌，即可使用。

（二）用于支原体分离培养的培养基

1.分离猪肺支原体的培养基

制备方法：新鲜牛脑心浸汤，加黏蛋白（0.5%），加火鸡血清（15%），加醋酸铊成l∶4000，每1ml浸汤中加青霉素1000～2000IU（分别灭菌或过滤除菌后混合）。

2.驴血清培养基

调pH值至7.6，按常规消毒灭菌。

3.Goodwin等氏复合培养基

制备方法：分三步：首先，Hartley消化汤：切碎牛心1500g，水2000ml，加热至80℃时，加入0.8%无水NaHCO₃ 2500ml，冷至45℃时，加入胰提取液500ml（去脂肪胰脏500g加1500ml水，加酒精500ml，置室温，常摇振，第3天用滤纸过滤），氯仿50ml。混匀后，置37℃6h或45℃3h，之后加浓硫酸40ml，蒸汽加热1h，纱布过滤，用NaOH调pH值至8，蒸气加热1h，趁热滤纸过滤，矫正pH值至7.6，装瓶高压消毒。其次，灭菌的Hartley消化汤300ml，无菌灭活的猪血清200ml，灭菌的0.5%的水解乳蛋白Hank’s液500ml，灭菌酵母浸液5ml，青霉素加至200IU/ml，醋酸铊加至1.25%，用灭菌的3.5% NaHCO₃调pH值至7.2，无菌分装，以胶塞塞紧。第三，固体培养基：将琼脂溶于Hank’S液中使其浓度达2%，高压灭菌，除青霉素外，其余各物预先放在56℃以下，待琼脂冷至56℃时，各物混合匀，倒平皿（琼脂终浓度为1%）。

4.鸡支原体培养基

制备方法：500g切碎牛心，1000ml水，4℃浸泡过夜，煮沸30min，过滤，补水至1000ml，加入蛋白胨10g，氯化钠5g，酵母提取液（酵母粉250g，加双蒸水1000ml，煮沸30min，离心取上清，121℃高压15min）10ml，矫正pH值至7.8，过滤（若制固体培养基时再加入琼脂），高压消毒后，冷至50℃时，加入20%无菌马血清，加醋酸铊0.02g，青霉素200IU/ml。分装试管或倾注平皿。

5.牛肺疫支原体的培养基

制备方法：加热溶化，调pH值至8.5，可补充胆固醇达0.1μg/ml，棕榈酸达5μg/ml。此培养基也叫爱德华氏培养基。

（三）用于鼻疽杆菌的培养基

1.硫堇葡萄糖琼脂

制备方法：上述3种成分混合后，115℃高压灭菌5min。用前加入1%硫堇酒精溶液（用50%酒精溶液）2.5ml，制成平皿即可。

2.孔雀绿酸性复红琼脂

制备方法：取已溶化的甘油琼脂100ml，加入下述色素溶液，摇匀后，制成平皿即可。

各成分分别灭菌后，混合。此培养基可抑制杂菌发育。

3.甘油琼脂

制备方法：上述前4种材料混合，加热溶化后加入甘油，调pH值至6.8～7.0，分装，以121℃灭菌20min。若为液体培养基，可不加琼脂。

（四）用于波氏杆菌的培养基

马铃薯培养基成分：

制备方法：将马铃薯去皮，削成薄片，每260g薯片中，加1000ml蒸馏水，尽量避免暴露于空气；充分振荡，放55℃～60℃温箱中过夜；由温箱中取出，纱布过滤；按浸出液量加入牛肉膏、氯化钠、蛋白胨、琼脂粉，加热溶解；待琼脂溶化后，加入甘油，搅拌均匀，以2mol/L NaOH调pH值为7.2～7.6；分装于所需中性容器中，以121℃高压灭菌30min，经37℃培养24h～ 48h，应无菌生长，pH值应为6.8～7.0。

该培养基也可用于布鲁氏杆菌、副结核杆菌等的培养。

（五）用于胎儿弯曲杆菌的培养基

1.增菌培养基（TEM）

制备方法：在无菌工作台中，按标准量混合分装于20ml带胶皮塞（能密闭）的玻璃瓶中，每瓶10ml，然后在100℃蒸气中加温3min，取出冷凝后，用灭菌棒搅拌后加胶塞封闭。再充入微氧气体（3.5% O₂、10% CO₂、86.5% N₂）。

2.选择性培养基

（1）CH培养基（半胱氨酸牛心浸膏培养基）

制备方法：上述各成分混合，调pH值至6.8，121℃30min高压灭菌。待培养基冷却至50℃时，加入100ml绵羊血，多黏菌素B 2IU/ml，Nivoliacin 2μg/ml，放线菌酮20μg/ml。

（2）2MH培养基（Mueller Hinton Agar）

制备方法：混合各成分，调pH值至7.6，121℃15min高压灭菌。冷却至50℃～55℃，加入0.025g的丙酮酸钠、硫代硫酸钠、硫酸亚铁和5%～10%绵羊血及抗生素（杆菌肽2500IU/L，放线菌酮50μg/L，硫酸多黏菌素1000IU/L，先锋霉素V 15ml/g，新生霉素5mg/L）。

（3）Thiogly Collate肉汤

制备方法：上述各成分混合，加热溶解，调pH值至7.2±0.2，每管分装15ml，121℃高压灭菌15min即成。

（六）用于炭疽杆菌的培养基

1.溶菌酶－正铁血红素琼脂

成分与制备方法：每毫升蛋白胨营养琼脂中加入正铁血红素（haemation）40μg，溶菌酶60μg。正铁血红素对炭疽杆菌无抑制作用，对其他芽孢杆菌有抑制作用。炭疽杆菌对溶菌酶的抵抗力大于其他芽孢杆菌。

2.Kinsely氏培养基

在Difco牛心浸汤琼脂中加入多粘菌素30IU/ml，溶菌酶40μg/ml，乙二胺四乙酸二钠400μg/ml，醋酸铊40ug/ml。

其他芽孢杆菌在此培养基中不生长，肠杆菌科细菌（除变形杆菌外）亦不能生长。

3.戊烷脒选择性琼脂

制备方法：混合上述各成分，调pH值至7.2～7.5，121℃高压灭菌15min，冷至56℃时，加戊烷脒（1∶30）水溶液0.1ml，多黏菌素B溶液（10000IU／ml）5ml，牛血或羊血20ml，摇匀，倾倒平皿。

（七）用于梭状芽孢杆菌的培养基

1.含铁牛乳脱脂奶粉培养基

成分与制备方法：含铁牛乳脱脂奶粉（含适量溴甲酚紫）100g，加1000ml蒸馏水，溶化后分装，每管10ml，每管中加人1g清洁的小铁钉，121℃高压灭菌30min（铁钉可重复使用，只须先在5%盐酸内煮沸，再用清水洗净）即可。

2.硫基乙醇酸盐肉汤

制备方法：将上述成分混合，然后热加溶解。以2mol/L NaOH液调pH值至7.0～7.2，分装于所需中性容器中，以115℃灭菌20～40min。

3.Weinberg氏肉－肝培养基

制备方法：调pH至1.8～2.0，45℃～50℃放置一夜，第二天调pH值至7.5，澄清，加入蛋白胨成分1%，葡萄糖成分0.1%～0.5%，115℃高压灭菌15min。

4.熟肉基（疱肉培养基）

将牛肉去筋膜、脂肪、绞碎放于三角瓶中，加等量水，煮沸1h后静置，肉渣下沉，校正pH值至7.2～7.6。过滤，将肉渣置试管的1cm高，上面再加肉汤高达4～5cm，液面上加少量液体石蜡，121℃高压灭菌30min。

5.叠氮钠血琼脂

制备方法：加热溶解上述成分，121℃高压灭菌30min，取出凉至50℃左右，加入脱纤绵羊血5%，再无菌加入0.1%水合氯醛水溶液（0.1g溶于100ml无菌蒸馏水内）1ml，倾注平皿即可。

6.叠氮钠胰蛋白血液肉汤

制备方法：前两种试剂混合，121℃高压20min，之后全部混合，分装（2ml/小试管），用时每管加人高压灭菌过的0.1%叠氮钠0.15ml和1∶25000的结晶紫溶液0.1ml。

7.乳糖蛋黄牛乳琼脂

制备方法：先加热溶化琼脂，冷至50℃时，加入已灭菌的其他成分，混匀后，倒制平皿。

（八）用于结核杆菌的培养基

1.潘曲吉尼（Pertragnani）氏培养基

制备方法：首先将脱脂奶、马铃薯淀粉、蛋白胨与切碎的马铃薯混合，水浴煮沸15min，不时摇动，或用玻棒搅拌糊状，继续加热灭菌1h，用灭菌蒸馏水补足蒸发的水分。取出冷至50℃，加入其余成分，用力摇振混匀后，用二层灭菌纱布过滤。用灭菌漏斗分装于试管内，斜置血清凝固器内，调温至85℃～90℃1～2h，使之完全凝固。间歇灭菌，每次30min，每天一次（第一天85℃，第二、三天80℃）。经检定无菌备用。

注意：所用玻璃器皿应事先灭菌，鸡蛋须事先在烧瓶内加玻璃珠摇碎后倒入。

2.青霉素血液琼脂

制备方法：将琼脂、中性甘油及蒸馏水混合，121℃10min高压灭菌，冷至50℃时，加入兔血与青霉素，混合，分装试管，制成斜面，换上灭菌软木塞。

（九）用于副结核杆菌的培养基

1.丹钦氏培养基

制备方法：将牛肝水、甘油和草分支杆菌浸液混合后，煮沸20～30min灭菌浸出。另取新鲜鸡蛋3个，无菌倒入带有灭菌玻璃珠烧瓶内，充分混匀，混入50℃的肝水混合液中，摇匀。再加龙胆紫酒精溶液，经二层纱布过滤后，分装于灭菌试管内，斜放于血清凝固器内间歇灭菌，第一次85℃30min，第二、三次80℃lh。

2.改良小川培养基

制备方法：将前5种成分加入蒸馏水中煮沸20～30min，然后无菌加入搅拌好的卵黄，再加孔雀绿酒精溶液，混匀后，用二层纱布过滤，分装于灭菌试管中，放血清凝固器内，间歇灭菌（同上）。

草分支杆菌甘油浸液制备：将草分支杆菌接种于牛肉汤培养基，把在37℃下培养2周的草分支杆菌培养物过滤，取25g沉淀，悬浮于100ml甘油中，121℃高压灭菌3h即可。

（十）用于布鲁氏杆菌的培养基

1.胰蛋白琼脂

制备方法：将上述成分混合，加热溶解；校正pH值至7.0，121℃高压灭菌20min后，分装于平皿备用。

此培养基也适用巴氏杆菌、李氏杆菌的培养。

2.肝汤培养基

制备方法：取去脂肪及筋膜的牛肝，用绞肉机绞碎，按肝水比例混合，搅拌均匀；用不锈钢或耐酸搪瓷缸加温至65℃～75℃，保温45min，继续加热至煮沸，保持1h，全部过程不断搅拌；煮完后，纱布过滤；按滤液加入上述物质；溶化后调pH值至7.0～7.2，分装，121℃高压灭菌30min。或加入3%甘油，0.5%葡萄糖，10%马血清，更有利于生长。如加入30～35g琼脂，则可倾倒平皿。

（十一）用于真菌的培养基

1.沙堡罗琼脂