实验十 细菌质粒DNA的转化试验
一、实验目的
（1）学习和掌握碱裂解法小量制备质粒DNA的原理、方法和技术。
（2）学习大肠杆菌感受态细胞的制备、转化及转化子鉴定的基本原理与操作技术。
二、实验原理
（一）质粒DNA的小量制备
质粒DNA是核外的环状双链DNA。在强碱作用下，核DNA与质粒DNA都会变形生成单链，在中性pH条件下质粒DNA发生变性，而核DNA保持单链状态，再通过一系列分离纯化即可得到纯化的DNA。
（二）大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
感受态指细菌生长过程中能接受外源DNA而不将其降解的生理状态。转化实验中，受体微生物需事先经处理制备为感受态细胞备用。
转化是将外源的DNA分子引入细胞，使其获得新遗传性状的一种手段。常见的转化方法有热激法和电穿孔法等。热激法是将细菌置于0℃的CaCl2低渗溶液中使细胞膨胀成球形，转化混合物中的外源DNA经42℃短时热激处理，进入受体，通过复制表达使受体细胞出现新的遗传性状。经筛选培养基中培养，即可获得转化子。
（三）转化子的鉴定
为了便于转化子的筛选鉴定，转化实验中采用的质粒DNA一般包含有特殊的遗传特征，如抗生素抗性基因、显色物质表达基因等，配合特定培养基可快速筛选出含有外源DNA的转化子。
三、实验材料及仪器
（一）材料
E．coli DH5α菌株，带有抗生素抗性基因且适用于E．coli DH5α的质粒如pUC18（带有氨苄青霉素抗性基因）等。
（二）设备
恒温摇床、电热恒温培养箱、台式高速离心机、无菌工作台、低温冰箱、恒温水浴锅、制冰机、分光光度计、微量移液枪、1．5mL EP管。
（三）试剂
（1）LB固体和液体培养基。
（2）氨苄青霉素母液（100mg／mL）。取Amp 0．5g溶于5mL无菌水中，0．22μm滤膜过滤除菌，分装后－20℃贮存。
（3）含氨苄青霉素的LB固体培养基。将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右，加入Amp储存液，使终浓度为50μg／mL，摇匀后铺板。
（4）0．05mol／L CaCl2溶液。称取0．28g CaCl2（无水，分析纯），溶于50mL重蒸水中，定容至100mL，高压灭菌。
（5）含15%甘油的0．05mol／L CaCl2。称取0．28g CaCl2（无水，分析纯），溶于50mL重蒸水中，加入15mL甘油，定容至100mL，高压灭菌。
四、实验步骤
（一）质粒DNA的小量制备
（1）分别配制培养基、溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ备用，其成分如下：
培养基：胰蛋白胨10g、酵母浸出物5g、NaCl 10g。
溶液Ⅰ：葡萄糖50mmol／L、Tris－HCl（pH 8．0）10mmol／L、EDTA 1mmol／L。
溶液Ⅱ（新鲜配制）：NaOH 0．2mol／L、SDS 1%。
溶液Ⅲ：KAc 29．4g、冰醋酸11．5mL、双蒸水28．5mL。
将配制好的溶液与包装好的枪头盒一起放入高压灭菌锅中灭菌。
（2）接种菌培养。
（3）取1．5mL培养物于EP管中，1 300rpm离心1min集菌，去上清；再加入100μL预冷的溶液Ⅰ，振荡器剧烈振荡，使菌体悬浮，此时可看到EP管变浑浊。
（4）加入200μL现配制的溶液Ⅱ，盖紧管口，可看到EP管变澄清，迅速柔和颠倒数次以保证混合液与整个管内壁充分接触，冰浴3～5min。
（5）加入150μL的溶液Ⅲ，温和颠倒数次以混合均匀，此时可看到EP管中有浆状沉淀，冰浴10min。
（6）13 000rpm离心10min，取400μL上清于另一EP管。
（7）用1mL 70%乙酸洗一次，1 300rpm离心5min，弃上清，将离心管倒置，温室干燥5～10min。
（8）用20～30μL TE溶解，－20℃保存。
（二）受体菌的培养及感受态细胞的制备
从LB平板上挑取新鲜E．coli DH5α单菌落，于LB液体培养基中37℃培养过夜直到对数生长期，以1∶100比例稀释接到LB液体培养基中，37℃250r／min培养3h（约含有109细胞／mL，OD600＝0．35～0．4）。取3．5mL菌液于4mL离心管中冰上放置30min，使其停止生长。5 000rpm离心5min，去上清。用冰冷的3mL 50mmol／L CaCl2洗涤菌体。5 000rpm离心5min，再用2mL 50mmol／L CaCl2轻轻悬浮菌体，冰上放置15～30min，4℃5 000rpm离心5min，弃去上清，用预冷的1mL CaCl2重悬制得大肠杆菌感受态细胞。
注意：新制成的感受态细胞悬液于4℃下放置24h内，可以有效提高转化效率。如果希望长期保存感受态细胞，可将细胞沉淀用甘油CaCl2悬浮，再将感受态细胞分成100μL的小份，存储于－70℃保存。
（三）转化
（1）在100μL的感受态细胞中加入10μL质粒，温和混匀，冰上放置30min后，立即放入42℃水浴热击90s，再迅速转移到冰浴中放置2～10min。
（2）加入400μL新鲜LB培养基，37℃250r／min培养1h，使菌体复苏并激活抗性标记基因。
（3）5 000rpm离心5min，用枪吸去上清，再用适量培养基重悬。取100μL涂布于含有筛选标记的LB平板上（平板培养基中已添加100μg／mL Amp），同时吸100μL未转化的大肠杆菌感受态细胞涂布于以上平板中，作为阴性对照。
（4）平板37℃正放1h充分吸收菌液后，倒置培养12～24h出现菌落。
五、实验记录
（1）自行设计表格记录实验结果。
（2）按下列公式计算转化效率：
转化效率＝转化子总数／质粒DNA总量（μg）
六、思考题
（1）质粒DNA提取过程中，加入溶液Ⅱ后，为什么不能剧烈振荡？
（2）如果阳性对照在选择平板上无菌落生长，而转化实验组有菌落生长，说明什么问题？如果是相反的结果，又说明什么问题？
（3）本实验的受体菌为什么要对氨苄青霉素敏感？与其他同学相比，你获得的转化效率高吗？你的体会是什么？
（4）本实验的转化方法，你认为有何可以改进简化之处？谈谈你的设想。
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