一、目的要求
了解植物病原细菌分离的基本原理，掌握平板划线分离法及纯化技术，熟悉划线分离的本质是稀释分离，以获得单菌落。
二、材料和用具
（一）实验材料
1.甘蓝黑腐病新鲜病叶若干。
2.培养基：牛肉汁蛋白胨培养基（NA培养基）。
3.灭菌水（三角瓶装）。
4.药品：70%的酒精、95%的酒精、0.1%的升汞液或5%的次氯酸钠。
（二）实验用具
灭菌培养皿、试管、吸管、吸水纸、移植针、移植铒、小刀、纱布、酒精灯、玻璃棒、铅笔、纸、标签纸、棉花、电炉、镊子、铝锅等。
三、内容和方法
（一）实验原理
在病组织的各个部位和其他基物中，病原细菌常常是和其他微生物混杂在一起的。 为了获得某微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧气等条件的特殊要求，供给它们适宜的生活条件，即让病原细菌生活在适宜的培养基上，或加入某种抑制剂创造只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而得到该菌的纯菌株。 为了获得分离菌的纯培养，必须要进行分离菌的纯化，纯化的方法类似于分离工作中采用的稀释分离法和划线分离法。
（二）平板划线分离法
1.制平板
预先把熔化好的NA培养基倒在培养皿中，凝成平板后，翻转放在30℃恒温箱中，使表面无水滴凝结，48h后取出备用。 也可凝成平板后直接使用。
2.取材
将细菌叶斑病（如甘蓝黑腐病）新鲜病叶用自来水冲洗掉表面的脏物（如泥土），选择典型的单个病斑，用剪刀或解剖刀从病斑边缘（病健交界处）切取小块（每边长3~4mm）病组织数块。
3.淋湿组织表面或表皮毛
将病组织放入70%的酒精中浸泡2~3s，消除寄主表面的气泡，淋湿组织表面或表皮毛。
4.表面消毒
把病组织移入0.1%的升汞液中处理0.5~5min。
5.制菌悬液
用在酒精灯火焰上灭菌的镊子，将已经用消毒水冲洗的分离材料夹1块放在装有少量灭菌水（1m L）的灭菌培养皿中，使用已经火焰灭菌的玻璃棒，将分离材料捣碎，并静置5~10min，制成菌悬浮液。
6.涂抹
用灭菌的移植饵（或移植环）蘸1环菌悬液，在平板培养基表面一侧边缘反复涂抹。
7.第一次平板划线
把移植饵重新灭菌，从上述涂抹区划出2条直线。
8.第二次平板划线
将平板转动一定角度，用灭菌后的移植饵从第一次划线的末端进行第二次划线。
9.第三次平板划线
再转动平板，继续划线，至基本划满整个平板（图11-1）。
图11-1 植物病原细菌平板划线分离法示意图
10.培养
划线完毕后，倒置平板，写上标签，并于26~28℃恒温箱中培养1~3d。
11.纯化
在划线分离平板培养皿中选择要求得到的典型菌落，从单个菌落上蘸少许菌液，然后在新的平板培养基上涂抹、划线。 如果第二次培养长出的划线菌落一致，就可选1个单菌落移到试管斜面培养基上培养而获得纯菌种。 反之长出的菌落不一致，还应继续划线纯化，直至菌落一致。
（三）注意事项
1.整个操作过程应保持无菌，防止污染。
2.平板划线时要注意移植饵（或移植环）的温度不能过高，且前两次划线后要对移植饵（或移植环）进行灭菌。
四、实验学时
3学时。
五、作业与思考题
1.每人交合格培养皿2个，并完成实验报告1份。
2.如果要从土壤中分离某种病原菌，应当采取什么样的分离方法更有效？
3.为什么分离材料要取病健交界处，且不能切取过大或过小？
4.在分离、纯化步骤中，要避免污染应注意哪些地方？
5.怎样判断你获得的病原菌的菌种是否是纯培养物？
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