微生物的分离纯化技术

实验五　微生物的分离纯化技术

一、目的要求

掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术。

二、基本原理

从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。

常用的方法有简易单细胞挑取法和平板分离法。

（1）简易单细胞挑取法　它需要特制的显微操纵器或其他显微技术，因而其使用受到限制。简易单孢子分离法是一种不需显微单孢操作器，直接在普通显微镜下利用低倍镜分离单孢子的方法。它采用很细的毛细管，吸取较稀的萌发的孢子悬浮液滴在培养皿盖的内壁上，在低倍镜下逐个检查微滴。将只含有一个萌发孢子的微滴放一小块营养琼脂片，使其发育成微菌落；再将微菌落转移到培养基中，即可获得仅由单个孢子发育而成的纯培养。

（2）平板分离法　该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理包括两方面。

①选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养、酸碱度、温度和氧等要求或加入某种抑制剂，造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。

②微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体，因此可通过挑取菌落而获得一种纯培养。获取单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术完成。值得指出的是，从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列的分离与纯化过程和多种特征鉴定方能得到。

本实验将通过稀释涂布平板法和平板划线法两种方式获得结冷胶生产菌株的纯培养。

三、器材

1.菌种:鞘氨醇单孢菌ATCC　31461。

2.培养基:结冷胶斜面培养基。

3.溶液或试剂:无菌生理盐水。

4.仪器或其他用具:无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环和无菌培养皿。

四、操作步骤

1.稀释涂布干板法

（1）倒平板　将结冷胶斜面培养基加热溶化，待冷至55～60℃时，倒平板。

倒平板的方法:右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边，用左手将试管塞或瓶塞轻轻地拔出，试管或瓶口保持对着火焰；然后用右手手撑边缘或小指与无名指夹住管（瓶）塞（也可将试管塞或瓶塞放在左手边缘或小指与无名指之间夹住。如果试管内或三角瓶内的培养基一次用完，管塞或瓶塞则不必夹在手中）。左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约15mL，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板（图2-8和图2-9）。

图2-8　持皿倒板法

图2-9　叠皿倒板法

（2）制备稀释菌液　取一支保藏的ATCC 31461甘油管，溶化后，用一支1mL无菌吸管从中吸取1mL菌悬液，加入盛有9mL无菌生理盐水的大试管中充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取1mL（无菌操作）加入另一盛有9mL无菌生理盐水的试管中，混合均匀，以此类推，制成10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6不同稀释度的菌液。

（3）涂布　将上述培养基的三个平板底面分别用记号笔写上10^-4、10^-5和10^-6三种稀释度，然后用无菌吸管分别由10^-4、10^-5和10^-6三管稀释液中各吸取0.1mL对号放入已写好稀释度的平板中，用无菌玻璃涂棒按图2-10所示，在培养基表面轻轻地涂布均匀，室温下静置5～10min，使菌液吸附进培养基。

图2-10　平板涂布示意图

平板涂布方法:将0.1mL菌悬液小心地滴在平板培养基表面中央位置（0.1mL的菌液要全部滴在培养基上，若吸移管尖端有剩余的，需将吸移管在培养基表面上轻轻地按一下便可）。右手拿无菌涂棒平放在平板培养基表面上，将菌悬液先沿一条直线轻轻地来回推动，使之分布均匀，然后改变方向沿另一垂直线来回推动，平板内边缘处可改变方向用涂棒再涂布几次。

（4）培养　将平板倒置于30℃温室中培养2～3天。

（5）挑菌落　将培养后长出的单个菌落分别挑取少许细胞接种到培养基的斜面上，分别置30℃温室培养，待菌苔长出后，检查其特征是否一致，若发现有杂菌，需再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。

2.平板划线分离法

（1）倒平板　按稀释涂布平板法倒平板，并用记号笔标明培养基名称、样品编号和实验日期。

（2）划线　在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，从甘油管中挑取一环在平板上划线。划线的方法很多，但无论采用哪种方法，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使之形成单个菌落。常用的划线方法有下列两种。

①用接种环以无菌操作挑取菌液一环，先在平板培养基的一边作第一次平行划线3～4条，再转动培养皿约70°，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线，再用同样的方法通过第二次划线部分作第三次划线和通过第三次平行划线部分作第四次平行划线。划线完毕后，盖上培养皿盖，倒置于温室培养。

②将挑取有样品的接种环在平板培养基上作连续划线。划线完毕后，盖上培养皿盖，倒置于温室培养（图2-11）。

图2-11　平板划线示意图

（3）挑菌落　同稀释涂布平板法，一直到认为分离的微生物纯化为止。

五、实验报告

1.结果

（1）你所做的涂布平板法和划线法是否较好地得到了单菌落？如果不是，请分析其原因并重做。

（2）简述鞘氨醇单孢菌ATCC 31461的菌落特征。

2.思考题

如何确定平板上某单个菌落是否为纯培养？请写出实验的主要步骤。