生物学研究技术

压力、温度等极端条件的模拟：绝大多数深海环境是恒定低温（1℃～4℃），只有热液喷口处是高温环境。因此，分离培养深海微生物时一般都需要模拟样品的原位温度，这在技术上并不存在难度。此外，压力是深海典型的环境特征，生存在这里的所有微生物均具有耐压/嗜压的特性，其中还包括少部分在常压下无法生长的嗜压菌。耐压菌的分离培养可以在常压下进行，虽然目前没有明确的证据，但是在分离中适当增加压力可能会提高获得更多深海微生物纯培养的概率。嗜压菌属于深海“土著”微生物，在科学研究上具有重要的价值。它们的分离培养必须利用专用的压力模拟装置，在高压下进行。这种压力模拟装置一般都是根据研究需求自行设计的，Jannasch 等设计了一套连续培养系统，可以让微生物在高达71MPa 的压力下持续生长。我国科研工作者也研发了深海微生物培养模拟平台，并应用于耐压菌的分离与研究。在压力装置的辅助下获得了一些深海嗜压的微生物，但由于培养条件要求比较严格，所以深海嗜压微生物的研究目前仍停留在理论研究阶段。

海洋微生物高通量分离培养技术：提高可培养微生物比例需要考虑两方面因素，其一是环境条件对微生物的影响，如上述基于微生物平板培养方法的改进；其二是在环境中微生物之间的相互影响。作为一个完整的群落，不同微生物的代谢产物对群落内其他微生物的生长具有不可忽视的作用。近年来发展起来的高通量分离培养技术就是针对这种作用而进行的改进。该技术的基本要点是：首先，制备包埋单个微生物细胞的琼脂糖（或其他包埋基质）微囊；然后，将包埋在微囊中的微生物在缓慢流动的海水中进行培养，培养结束后用流式细胞仪分选含有微菌落的微囊；最后，将分选的微菌落进行扩大培养。该技术最大限度地模拟了自然环境，使所有的微生物处在一个开放的、连续的培养环境中，代谢产物和信号分子可以互相交换，不破坏微生物之间的生态联系。同时，又将单个微生物分离开培养，避免了混合培养时的营养竞争问题，使大量的微生物能够获得纯培养。科学家对包埋基质及包埋方法等进行了改进，并从我国的黄海和南海中获得了大量的微生物新种，目前正进一步改进该技术，以应用于深海微生物的分离培养。

环境宏基因组技术：自从1991年Pace等首次构建了海洋微小浮游生物环境DNA文库以来，目前已构建众多的海洋环境样品的宏基因组文库。所采用的载体种类包括Cosmid、Fosmid、BAC、K2噬菌体以及穿梭载体，其中Cosmid、Fosmid 和BAC 是目前常用的载体。BAC 插入的片段大（可达350kb），但克隆效率低，因此，目前仅应用于筛选微生物次生代谢产物这类由基因簇控制的活性物质。其他的深海微生物活性物质研究一般都采用Cosmid和Fosmid载体。这两个载体的插入片段较小（35～40kb），但可以满足极端酶等单基因控制的活性物质的研究。而且它们的克隆效率较高，尤其是Fosmid插入片段在E.coli中的克隆效率和稳定性更高，因此，目前Fosmid已经成为最常用的载体。