一、目的要求
认识植物病原细菌的形态和菌龄特征，学习并掌握细菌革兰氏染色的方法，熟悉细菌细胞壁结构与革兰氏染色的基本原理。
二、材料和用具
（一）实验材料
1.供试菌种
白菜细菌软腐病菌（Erwinia carotovora subsp.carotovora）的斜面培养（待测菌），枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的斜面培养（阳性对照菌），甘蓝黑腐病菌（Xanthomonas campestris pvc.ampestris）的斜面培养（阴性对照菌）。
供试菌种必须在使用前5d移植，临用前18~24h再转试管1次，以保证菌体处于分裂活跃时期。
2.染液
（1）结晶紫草酸铵染剂
溶液I（结晶紫2.0g，95%的酒精20m L），溶液II（草酸铵0.8g，蒸馏水80m L），混合溶液I和II，滤纸过滤，贮存于试剂瓶中，24h后使用。
（2）鲁戈尔碘液
碘1.0g，碘化钾2.0g，蒸馏水300m L。
将碘和碘化钾放入同一研钵中研磨，研磨时缓慢加水直至碘和碘化钾溶解，然后加水稀释到300m L，装入棕色试剂瓶，放于暗处备用。
（3）复染剂
先配制原液，用蒸馏水稀释后为复染剂。
原液：番红O（藏红）2.5g，95%的酒精100m L。
复染剂：原液10m L，蒸馏水90m L。
（二）实验用具
移植饵、无菌水、显微镜、吸水纸、清洁试管、镊子、清洁无脂载玻片、脱脂棉、草纸、装有酒精的试管等。
三、内容和方法
（一）实验原理
革兰氏染色是丹麦病理学家Gram于1884年创立的，是细菌学中最重要的鉴别染色法，这种方法将细菌分为革兰氏阳性细菌（G＋菌）和革兰氏阴性细菌（G-菌）。革兰氏阳性细菌细胞壁的肽聚糖层较厚，经乙醇处理后发生脱水使孔径缩小，结晶紫与碘的复合物保留在细胞内而不被脱色；而革兰氏阴性细菌细胞壁的肽聚糖层很薄，脂肪含量高，经乙醇处理后部分细胞壁可能被溶解并改变其组织状态，细胞壁孔径变大，不能阻止溶剂透入，因结晶紫与碘的复合物被洗去而脱色。 最后革兰氏阳性细菌呈蓝紫色，革兰氏阴性细菌呈红色。
（二）实验方法
1.配制菌悬液
用无菌蒸馏水将培养18~24h的菌种配制成菌悬液。
2.涂片、固定
在洁净无脂的载玻片上，用移菌饵取菌液涂片，在同一张载玻片上分别涂上枯草芽孢杆菌（G＋菌对照）、甘蓝黑腐病菌（G-菌对照）和白菜细菌软腐病菌（待测菌）（图12-1），晾干后在酒精灯火焰上通过2次，固定涂片，并写上标记。
图12-1 涂片示意图
3.染色
在涂片上滴加结晶紫草酸铵染剂（覆盖三条菌膜），染色1min。
4.水洗
用水冲去染色剂，轻轻甩去载玻片上的水，用吸水纸吸干。
5.媒染
滴加鲁戈尔碘液，染色1min。
6.水洗
用水冲去碘液，轻轻甩去载玻片上的水，用吸水纸吸干。
7.褪色
将载玻片倾斜，在白色背景下，从上端滴下95%的酒精，使其顺着整个载玻片均匀地向下流，直至流下的酒精无色。褪色时间不可超过30s。
8.水洗
褪色后立即水洗，轻轻甩去载玻片上的水，用吸水纸吸干。
9.复染
滴加番红O复染10s。
10.水洗
用水冲去复染液，吸干，镜检。 革兰氏阳性细菌呈蓝紫色，革兰氏阴性细菌呈红色。
（三）注意事项
1.酒精脱色是革兰氏染色的关键环节。 脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌；脱色过度，阳性菌则被误染成阴性菌。 脱色时间一般为20~30s，不超过30s。
2.注意使用活跃生长期的培养物，菌龄18~24h，菌悬液不能太浓，涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性。
四、实验学时
3学时。
五、作业与思考题
1.每人交检测玻片1~2片，并完成实验报告1份。
2.实验过程中为什么用已知革兰氏阳性细菌和阴性细菌作对照？
3.试分析革兰氏染色成功的关键。
4.简述病原细菌革兰氏染色的基本原理及意义。
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