菌种分离技术

时间：2022-11-16 百科知识版权反馈

【摘要】：食用菌组织分离法是利用子实体机体内部的组织在无菌条件下培养、提纯来分离获得纯菌丝的一种方法。下面介绍几种典型的食用菌组织分离法。该过程宁缺毋滥，不好的菌种坚决不用。接种整个过程要注意始终将试管口处于酒精灯火焰无菌区。

（二）菌种分离技术

食用菌的菌种分离可以分为孢子分离、组织分离和基内菌丝分离三种。

1.组织分离法

食用菌组织分离法是利用子实体机体内部的组织在无菌条件下培养、提纯来分离获得纯菌丝的一种方法。该法操作简便、材料易得、变异率小，同时能较好地保持食用菌品种的种性。下面介绍几种典型的食用菌组织分离法。

（1）大型伞菌组织分离

一些大型的食用菌品种，如香菇、平菇、蘑菇、大球盖菇等，其菇盖肥厚，菌柄粗壮，可以方便地从其子实体上获得组织块。这种类型的子实体组织分离方法流程如图4-4所示。

图4-4　大型伞菌组织分离流程

①选择种菇：挑选发育正常、朵型完好、符合品种特征、无病虫害的五六分成熟的菇作为分离种菇。香菇选择菇型圆整、菌盖肥厚、呈深褐色且铜锣边明显、边缘内卷、柄粗而短、出菇早、无病虫害的五六分成熟的子实体；平菇选择出菇早、转潮快、菌盖厚实、菌柄粗短、色泽较好的五六分成熟且无病虫害的子实体；双孢蘑菇选择菇型圆整、光滑、色泽洁白、柄粗盖厚的无病虫害、健壮的五六分成熟的子实体。

②种菇处理：将选好的子实体用清水洗净，静置一段时间，使其脱去表层部分水分。

③种菇消毒：将处理好的种菇放入超净工作台内，用0.2%升汞溶液或75%的酒精擦拭种菇，再用无菌水冲洗1～2次，之后用无菌纱布吸干菇体表层水，放入经过灭菌的培养皿内。

④无菌接种：点燃酒精灯，将消毒过的小刀进行火焰灼烧，待小刀冷凉后，把菇蕾纵剖为二，在菇盖与菇柄相接处的部分切取绿豆大小菌肉，用无菌镊子移接在斜面培养基中央，之后棉塞轻微过火塞住试管口。接种整个过程要注意始终将试管口处于酒精灯火焰无菌区。

⑤培养、检查：接种后的母种试管于25℃环境中暗光培养，及时检查母种试管，污染的母种管剔除掉，留下没有污染的菌种。该过程宁缺毋滥，不好的菌种坚决不用。

⑥转管纯化：3～5天后，发现菌落直径达0.5～1厘米时，及时在无菌环境下挑取菌落先端菌丝移至空白母种培养基上培养，培养条件同上。如此反复操作2～3次后即可获得较纯的母种。

（2）耳类组织分离

一些不具备伞形结构的食用菌品种，如黑木耳、银耳、榆耳、花耳等，其子实体呈耳片状，这种类型的子实体组织分离方法流程如图4-5所示。

图4-5　耳类组织分离流程

下面以黑木耳为例进行说明。

①选择种耳：挑选朵形大、肉厚、富有弹性、颜色黑亮、无病虫害、健壮的七分熟木耳作为分离种耳。

②种菇处理：将选好的子实体用清水洗净，静置一段时间使其耳片略显收缩。

③种菇消毒：将处理好的种耳放入超净工作台内，用无菌水反复冲洗1～2次，之后用无菌纱布吸干耳片表层水，放入经过灭菌的培养皿内。

④无菌接种：点燃酒精灯，将消过毒的小刀进行火焰灼烧，待小刀冷凉后，切取0.1平方厘米左右的组织块耳片，用无菌镊子移接在斜面培养基中央。之后棉塞轻微过火塞住试管口。接种整个过程要注意始终将试管口处于酒精灯火焰无菌区。

⑤培养、检查：同大型伞菌组织分离。

⑥转管纯化：同大型伞菌组织分离。

（3）菌核组织分离

一些食用菌子实体形状特殊，如茯苓，其子实体为海绵状，外表不整齐，我们对该类型的食用菌组织分离不易，但我们对它的地下菌核却很好分离，其方法流程如图4-6所示。

图4-6　菌核组织分离流程

①采集菌核：挑选皮薄、表面有裂纹、颜色为棕红色、肉质白色、重量适宜的新鲜菌核作为分离材料。

②菌核处理：将选好的子实体用清水洗净，静置一段时间待表皮略显收缩。

③菌核消毒：将处理好的菌核放入超净工作台内，用0.2%升汞溶液或75%的酒精浸泡30秒左右，之后用无菌水反复冲洗1～2次，之后用无菌纱布吸干菌核表层水，放入经过消毒、灭菌的培养皿内。

④无菌接种：点燃酒精灯，将消过毒的小刀进行火焰灼烧，待小刀冷凉后，将菌核一分为二，切取靠近表皮的一块菌肉，用无菌镊子移接到斜面培养基中央。之后棉塞轻微过火塞住试管口。接种整个过程要注意始终将试管口处于酒精灯火焰无菌区。

⑤培养、检查：接种后的母种试管于20℃环境中暗光培养，及时检查母种试管，污染的母种管剔除掉，留下没有污染的菌种。

⑥转管纯化：同大型伞菌组织分离。

（4）小型伞菌组织分离

一些小型的食用菌品种，如金针菇、茶薪菇等，其菇盖较薄，菌柄细长，不易从其子实体上获得组织块。这种类型的子实体组织分离方法流程如图4-7所示。

图4-7　小型伞菌组织分离流程

①选择种菇：挑选颜色好、发育正常、丛生性好、产量高、符合品种特征、无病虫害的六分成熟的菇作为分离种菇。

②种菇处理：将选好的金针菇静置一段时间使其脱去表层部分水分。

③种菇消毒：将处理好的金针菇放入超净工作台内，再用无菌水冲洗1～2次，之后用无菌纱布吸干菇体表层水，放入经过灭菌的培养皿内。

④无菌接种：点燃酒精灯，将消过毒的镊子进行火焰灼烧，待镊子冷凉后，沿菌柄向上去掉菌盖，在菇柄尖端处夹取绿豆大小菌肉，迅速移接在斜面培养基中央。之后棉塞轻微过火塞住试管口。接种整个过程要注意始终将试管口处于酒精灯火焰无菌区。

⑤培养、检查：接种后的母种试管于25℃环境中暗光培养，及时检查母种试管，污染的母种管剔除掉，留下没有污染的菌种。

⑥转管纯化：同大型伞菌组织分离。

（5）其他食用菌组织分离

还有一些特殊的食用菌，如猴头菇，可以通过其内部菌肉进行组织分离来获得菌种；鸡油菌、蜜环菌、假蜜环菌等一类，可以通过其菌索进行组织分离来获得菌种；灵芝可以选取五六分熟的菌盖边缘尚发白的组织块，通过对其进行组织分离来获得菌种；竹荪可以选择适龄的菌蕾进行组织分离来获得菌种。

2.孢子分离法

食用菌孢子分离法是在无菌条件下，利用成熟子实体弹射出来的有性孢子在适宜的培养基上萌发成菌丝，而获得纯种的一种方法。下面介绍几种典型的食用菌组织分离法。

（1）多孢分离法

该法是利用子实体弹射许多孢子在同一培养基上，让其萌发、自由交配，从而获得纯母种的方法（图4-8）。该法简便易行，在食用菌选种中应用普遍。

图4-8　多孢分离流程

①整菇孢子弹射法：该法适用于伞菌类的孢子采集。在接种箱中，将经消毒处理的整只种菇插入无菌孢子收集器里，于见光、适温下使菇自然弹射孢子。24小时后，将孢子收集器移至无菌室（箱）中，打开钟罩，从培养皿内获取孢子。

②试管插割法：在无菌箱内，迅速用无菌试管插割种菇有菌褶一侧，直至取下组织块。用接种镐将组织块推至距斜面培养基1厘米处，塞好棉塞即可。于25～28℃条件下见光竖立培养至12小时左右，在无菌操作条件下用尖头镊子取出组织块。继续于25～28℃的条件下暗光培养，2～3天后，会看到孢子萌发成星芒状的孢子菌落。

③三角瓶勾悬法：在无菌箱内，将耳片或菌盖用无菌水洗涤、无菌纱布吸干，取一个事先准备好的金属钩，经火焰灭菌后一端钩住耳片或菌盖（菌褶朝下），另一端钩在三角瓶口上，加棉塞，于室温下见光培养1～2天，见培养基表面获得孢子粉时即可。

④贴褶法：在无菌箱内，用无菌镊子夹取一片即将弹射孢子的菌褶，使其一端蘸取无菌水，贴至试管斜面培养基上方，塞好棉塞即可。于25～28℃条件下见光培养至12小时左右，在无菌操作条件下用尖头镊子取出菌褶。继续于25℃的条件下暗光培养，2～3天后，会看到孢子萌发成星芒状的孢子菌落。

（2）单孢分离法

单孢分离是从收集到的多孢子中将单个孢子分离出来，分别培养，作为育种的材料。该法是利用子实体弹射许多孢子制成孢子悬浮液，利用稀释、平板划线分离法、器械分离法和毛细管法获取单孢子的方法。该法在食用菌育种中应用普遍。单孢分离的方法常用的主要有两种：涂抹法和梯度稀释点样法。

①涂抹法：分离方法流程如图4-9所示。

图4-9　涂抹法分离流程

获多个孢子：通过整菇孢子弹射法、试管插割法、三角瓶勾悬法和贴褶法等方法获得大量多孢子。

配制无菌孢子液：用已蘸无菌水的接种环，从前面获得的孢子粉上沾取孢子，在无菌条件下，插入盛有无菌水的三角瓶内振荡稀释成适宜浓度的孢子悬浊液。

平板划线培养：在无菌条件下，用无菌的接种环蘸取孢子悬浊液，于酒精灯无菌区在平板内培养基上轻划数条“Z”形线，使蘸到接种环上的孢子悬浊液沿“Z”形线均匀分散开。之后将平板培养基置于25℃下遮光培养。

挑取单孢菌落：在无菌条件下，用无菌的接种针挑取“Z”形线上的单孢群落，并通过镜检来确定是否为单孢菌丝。

②梯度稀释点样法：分离方法流程如图4-10所示。

图4-10　梯度稀释点样法分离流程

a.配制无菌孢子液：通过整菇孢子弹射法、试管插割法、三角瓶勾悬法和贴褶法等方法获得大量多孢子。用已蘸无菌水的接种环，从前面获得的孢子粉上沾取孢子，在无菌条件下，插入盛有无菌水的三角瓶内振荡稀释成适宜浓度的孢子悬浊液。

b.配制梯度孢子液：取5支试管，分别装9毫升蒸馏水，经高压灭菌制成无菌水。用无菌注射器吸取1毫升孢子悬浮液于第1支试管中，摇振使其分散；再从第1支试管中吸取1毫升注入第2支试管……如此直至稀释到第5支试管。这样按无菌操作规程将孢子悬浊液配制成梯度孢子悬浮液，每个梯度间的孢子液浓度稀释10倍（图4-11）。