离心技术的分类

离心技术是医学与生物学领域广泛使用的重要手段,根据离心原理,可设计多种离心方法,常见的有沉降离心、差速离心和密度梯度离心三大类型,在实际工作中,应根据生物样本的来源、特点及离心的目的,合理选择离心技术。

(一)沉降离心法

只选用一种离心速度,使溶液中的悬浮颗粒在离心力的作用下完全沉降下来。沉降离心一般要求液体介质的密度较小,待沉降的颗粒大小差异不大,这样颗粒的沉降系数才会基本一致,其目的就是将液体介质和颗粒进行分离,因此,选用的离心速度要偏大,才能保证沉降系数较小的颗粒也能完全沉降。该技术是检验领域使用较多的一种离心技术,主要用于样品的前处理过程。

(二)差速离心法

差速离心法是利用不同的粒子,在同一离心条件下,沉降速度不同,通过不断增加相对离心力,使在非均匀混合液内大小形状不同的粒子分步沉淀,也称差分离心、分步离心、差速分级离心等。该法一般要求悬浮颗粒的大小、密度和形状等有明显的不同,各颗粒之间的沉降系数才会有较大差别。差速离心一般能分离沉降系数相差10倍以上的颗粒。

差速离心法主要适用于相对分子质量或沉降系数差别较大、不稳定、易变性、易受梯度介质损伤的颗粒,操作相对简便,可用于大量样本的初步分离。但分离复杂样本及纯度要求较高时,离心次数要多,容易引起组分的丢失,另外,对于沉降系数相差不大的组分难以进行完全的分离提纯。

(三)密度梯度离心法

密度梯度离心又称区带离心,是在密度梯度介质中进行依密度而分离的离心方法。即使用一定的密度梯度介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度,将待分离样品置于介质的顶部,通过重力和离心力场的作用使各组分被分配到对应密度的梯度液中形成不同区带的离心方法。按照离心分离原理,密度梯度离心可分为速度区带离心(连续密度梯度离心)和等密度离心(不连续密度梯度离心)两种方式。

1.速度区带离心法 根据被分离组分分子形状、大小各异,在密度梯度液中的沉降系数不同建立起来的离心方法。离心前,离心管内先装入等密度梯度介质(如蔗糖、甘油、CsCl、KBr等),静置后,在重力作用下通过扩散,形成一个底部浓度大、顶部浓度小的连续密度梯度液,将待分离样品铺在梯度液的顶部,选择合适的转速和时间进行离心,利用各颗粒在梯度液中沉降速度或漂浮速度的不同,使具有不同沉降速度的颗粒处于不同密度的梯度层内,达到彼此分离的目的。

速度区带离心法分辨率高,组分间沉降系数相差20%以上即可选用此法,并且离心时间较短,一次即可分离出较纯的颗粒。其分离效果主要与被分离物质的大小和形状有关,与介质的密度无关。本法可分离各种细胞、病毒、染色体、脂蛋白、DNA和RNA等生物样品。

2.等密度离心法 等密度离心是依赖于样品颗粒的不同密度进行离心分离的。当样品中各组分密度差异明显时,在离心力的作用下,各组分在密度梯度介质中按密度大小不同沉降到与其密度相等的位置,在该处受力达到平衡,从而停留在该密度层。因此分离效果主要与被分离物质的密度有关。

等密度离心法离心前先配制介质密度梯度液(如CsCl溶液),混合样品可以铺在梯度液之上,也可以置于梯度液之下,甚至和梯度液混在一起。离心开始后,依靠离心力逐渐形成管底大、管顶小的密度梯度(自形成梯度),原来分布均匀的粒子也发生重新分布。当管底介质密度大于粒子密度时,粒子上浮,在管顶处,粒子则下降,也就是样品各单一成分向它们自己的等密度区靠近,最后粒子进入到一个它本身的密度位置达到平衡,从而得以分离纯化。

对于速度区带离心,梯度液最大密度一般小于样品中各组分的密度,也就是说是在样品正在沉降过程中分离样品;而等密度离心法中,梯度液的初始最大密度常常超过样品各组分的密度,利用每个单一组分沉降或上浮到它们各自的等密度区达到分离的目的。

等密度离心法适用于物质大小相近,而密度差异较大样品的分离。