植物分型技术

一、植物DNA分型技术

法医植物学（Forensic Botany）是研究植物证据在法庭上应用的学科，它包括许多分支学科，如植物解剖学、植物生殖生物学、植物分类学、植物分子生物学、孢粉学和湖沼生物学。传统的现场植物检材的检验方法主要是形态学比较和生化分析。但植物的形态学比较要求检验者是经验丰富的植物学专家，其应用受到限制并且难以达到个体识别的标准。植物DNA大量存在于线粒体、细胞核和叶绿体中，采用分子生物学技术分析植物样本的DNA，可以提供许多信息用以鉴定植物样本。

目前常用的法医植物DNA分型包括以下几种技术。

1．随机引物扩增DNA（randomLy amplified polymorphic DNA，RAPD）技术早期由于缺少植物DNA的序列信息，研究者多采用随机扩增多态性DNA（RAPD）进行鉴定。1992年发生在美国亚利桑那州的一起凶杀案中，在该州沙漠中的1棵假紫荆树下发现1具女性尸体，调查者找到了1个嫌疑人，并在他的卡车上发现了少量假紫荆树的豆荚种子。案件负责人想知道这些种子的DNA分析结果是否与尸体旁的假紫荆树匹配。来自亚利桑那州大学的HELENTJARIS使用RAPD技术分析2份样本和对照样本，结果在样本中都获得了相同的特异性条带，从而帮助确认了嫌疑人就是凶手。

2．限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）技术2003年，KORPELAINEN等报道了1宗案件，法医学者应用RFLP技术，分析在嫌疑人车上找到的一些苔藓微粒以及嫌疑人外套上的苔藓物质，认为其来源于犯罪现场生长的苔藓，成功地为联系嫌疑人和犯罪现场提供了证据。此外，RFLP技术常用于大麻品种的鉴定。

3．STR分型技术2003年，H-Hsing-Mei等对印度大麻（包括树叶和种子）的108份样本进行了研究，从中寻找到了适用于确定大麻的STR基因座。CRAFT等发现，在不同来源的沙生槲树树叶的DNA分析中，应用4个微卫星基因座时，其联合匹配概率即可达到2．06×10^－6。

4．核基因组特定基因位点的检测核基因组具有丰富的遗传信息，目前法医学上最常使用的是核rDNA（核糖体DNA）的内转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）序列测定。该区域位于18 S和26 S的rRNA基因之间，包括一段进化上高度保守的序列5．8 S亚基和两个基因间隔区ITS－1和ITS－2（图27－3）。

刑侦人员希望可以通过对绑架案中敲诈信上的微量植物物证进行分析，以发现人质被囚禁的地理位置，于是博德公司（Bode Technology Group）利用植物核基因组的序列多态性位点（18 S rDNA，ITS－1，ITS－2）建立了1套对植物检材进行提取、克隆、测序的程序。他们发现许多植物都有相对有限的地理分布以及特殊的分布取向，有的分布在路边或建筑工地，有的却只出现在荒漠。通过将植物物证的DNA检测结果和相应的地理区域联系起来，可以建立1个数据库。此外，对大麻种子的检验也用到了ITS－1区域。

图27－3　植物18 S～26 S rRNA的基本结构

5．叶绿体基因组（cpDNA）上特定基因位点的序列测定cpDNA是植物所特有的，长度为71～217 kb，呈环形，其最明显的特点是有1段约25 kb的反向重复序列。该重复序列将基因组其余部分分成2个单拷贝区。迄今已报道的具有系统学价值的叶绿体基因有20多个，在法医学中使用的主要是trnL内含子和trnL－F基因间隔区。它是位于叶绿体DNA上的1段单拷贝序列（图27－4），编码tRNA，最早被TABERLET等用来研究植物居群生物学和进化。中国台湾学者对当地的373株植物个体进行了这两个位点的序列检测。这些样本来自80个科、206个属和269个种。结果显示，在不同科和属之间没有出现相同的序列，且多数不同种的植物在这两个位点的序列也不相同。盲测结果也与Genbank和EMBL上的数据吻合。这提示用这种DNA测序方法可对未知的植物检材进行初步的种属分类。

trnL内含子和trnL－F基因间隔区还被用于疑似大麻的植物种子的鉴定。植物种子所能提供的形态学分类特征有限，传统的办法是将这些种子播种，待其发芽后再对叶片进行检验。这往往花费较长时间，且受发芽率的影响。中国台湾法医学者对1l份可疑检材（种子）的trnL内含子和trnL－F基因间隔区以及ITS1区进行测序，并将结果分别与GenBank上大麻的数据比较，均得到了100%吻合的结果。同时，学者们还对这些样品种子发芽后的叶片进行检验，也得出了一致的结果。这些样品被认定为大麻的种子，这一结论被法院采纳作为证据。叶绿体上其他被研究使用的基因位点还有RHCL，ATPB以及NDH等。然而，植物分子系统学的观点认为，叶绿体上的这些位点主要适用于植物属及以上分类水平的植物种类鉴别，否则可能出现错误结果。而且单个位点提供的遗传信息有限，不能用于植物物证的单株识别。

图27－4　trnL内含子和trnL－F基因间隔区的组成

箭头表示引物作用的位置和方向。引物序列源自Taberlet，1991

6．植物线粒体基因组（mtDNA）上特定基因位点的检测植物的mtDNA和cpDNA相似，为闭环双链，长度在200～2 000 kb，也存在长反向重复序列。法医学者利用植物mtDNA上一些基因位点的长度多态性在草本植物科以下的低阶分类层面获得了很有价值的成果。

WARD等利用线粒体nad7，nad5基因内含子的长度多态性对早熟禾亚科（Pooideae）和黍亚科（Panicoideae）2个近缘亚科及其以下各级分类层次的草本植物构建了分类结构。20个样本的检验结果很好地吻合了传统分类学的标准，同时其他亚科植物样本的对照检测也基本能得到排除性的结果。因此，利用这2个位点可以建立起1个小规模的植物DNA分子认证系统，能够对该系统范围内的植物进行快捷的种属认定。